CRISPR/Cas9系统介导的猪MRC1修饰基因降低PCV2复制的研究

旨在获得MRC1基因修饰的PCV2靶细胞并在体外验证该细胞对PCV2的抑制作用,为后续基因编辑猪的生产提供理论基础。本研究:1)首先利用基因工程技术建立了慢病毒介导的高效同源重组载体和CRISPR/Cas9基因靶向系统;2)通过细胞和分子生物学技术筛选了定点整合表达MRC1的PK15细胞系;3)随后通过细胞试验和PCV2的攻毒试验对其抗PCV2的作用进行了相关验证。结果:1)成功构建了含有红色荧光标记基因、嘌呤霉素标记基因、同向LoxP序列和多克隆位点的pLV-LoxP-mCherry-puro-LoxP载体,同时根据不同猪品种间MRC1基因启动子差异序列设计同源臂,成功构建同源重组载体和靶向同源臂的CRISPR/Cas9基因靶向载体;2)通过病毒包装和共转染的方法,利用嘌呤霉素筛选并验证了MRC1启动子基因编辑的PK15细胞株,成功将MRC1基因转录起始位点上游多出的14 bp敲入到PK15细胞中;3)随后对基因编辑的PK15细胞系进行抗病毒验证,MRC1基因编辑的PK15细胞株MRC1的蛋白表达量显著增高(P<0.05),同时显著降低了PCV2的复制(P<0.05)。MRC1启动子编辑的PK15细胞中MRC1蛋白表达量显著增高,该位点可以用于抗PCV2猪的制备。

中国汉族和维吾尔族MRC1基因多态性与肺结核病的相关性

目的探讨中国汉族和维吾尔族人群MRC1基因多态性与肺结核病易感性的联系。方法应用PCR和DNA测序技术,对中国汉族454例和维吾尔族595例人群的MRC1基因的第7号外显子6个SNPs(G1186A、G1195A、T1212C、C1221G、C1303T和C1323T)基因型及基因频率分布进行检测,并进行连锁不平衡分析。结果中国汉族人群中G1186A位点等位基因G型分布频率在肺结核病组和正常健康组之间存在显著差异(P=0.037;OR=0.76;95%CI:0.58～0.98);AG基因型在两组之间存在显著性差异(P<0.01;OR=0.57;95%CI:0.37～0.87)。在年龄和性别校正后,G1186A位点在显性(P<0.01;OR=0.59;95%CI:0.40～0.87)、超显性(P=0.045;OR=0.69;95%CI:0.47～0.99)和加性模式(P=0.041;OR=0.76;95%CI:0.59～0.99)时,与肺结核病存在显著相关性。在维吾尔族人群中G1186A位点的等位基因G的分布频率在两组之间的分布具有显著性差异(P=0.031;OR=1.29;95%CI:1.02～1.62);基因型分析发现AA基因型在两组之间也存在显著性差异(P=0.033;OR=1.64;95%CI:1.04～2.60);在年龄和性别校正后,G1186A位点在加性模式下与肺结核病存在相关性(P=0.033;OR=1.28;95%CI:1.02～1.61)。连锁不平衡分析发现,构建的单体型GGTCCT(P=0.032;OR=0.75;95%CI:0.57～0.97)和GGTCCC(P=0.044;OR=0.57;95%CI:0.33～0.99)与肺结核病存在显著的相关性。结论 MRC1基因G1186A位点与中国人群肺结核病相关。