蜂王浆中主蛋白成分(MRJP2)的分离纯化及圆二色谱分析

利用亲和层析、分子筛层析和离子交换层析从新鲜蜂王浆中提取蜂王浆中主蛋白成分（MRJP2）的单一组分，经SDS电泳和质谱鉴定为MRJP2后，再通过圆二色谱技术对MRJP2在不同温度、不同pH值、不同离子浓度下二级结构的变化情况进行检测。结果表明：10-90℃升温过程中，α螺旋比例增加、β折叠和无规则卷曲比例减少，β转角比例变化不大；pH值由4．0上升到9．0过程中，α螺旋比例先减少后增加，β折叠比例在pH5．0时最高，β转角比例基本不变，无规则卷曲比例在pH8．0时最高；蛋白溶液中添加不同金属离子后，Ca^2＋可以促进α螺旋比例增加，而Mg^2＋和Zn^2＋会明显降低α螺旋比例。

蜜蜂属六蜂种间MRJP2基因C-端重复序列的比较分析

构建了中华蜜蜂(Apis cerana cerana,中蜂)8日龄工蜂头部cDNA文库,获得了中蜂王浆主蛋白2(major royaljelly protein2,MRJP2)的全长cDNA序列,该序列长1605bp,包含一个编码468个氨基酸的开放阅读框(open readingframe,ORF)。在中蜂MRJP2的cDNA序列的C-端,首次发现存在串联重复片段长度多态性(variable numbers oftandemrepeat,VNTR)。克隆并测定了蜜蜂属Apis内其他5个种的MRJP2基因的C-端重复序列,结果表明:在蜜蜂属的其他5个种中,C-端重复片段的核心序列是以碱基高度突变方式而表现出个体之间的多态性,而重复片段长度基本一致。中蜂与西方蜜蜂A.mellifera,大蜜蜂A.dorsata与黑大蜜蜂A.laboriosa,以及小蜜蜂A.florea与黑小蜜蜂A.andreniformis分别形成3个进化枝。中蜂和西方蜜蜂与大蜜蜂和黑大蜜蜂之间的亲缘关系较近,而与小蜜蜂和黑小蜜蜂的亲缘关系较远。

蜂王浆主蛋白2在昆虫细胞-杆状病毒系统中的表达与鉴定

本研究旨在利用昆虫细胞-杆状病毒表达系统表达蜂王浆主蛋白2(MRJP2),为后续MRJP2功能的深入研究提供材料。根据GenBank中意大利蜜蜂(Apis mellifera L.)MRJP2基因序列,经PCR扩增、克隆至真核表达载体pFastBac1,构建重组杆状病毒质粒MRJP2-Bacmid并转染至Sf9昆虫细胞,以P2代杆状病毒感染Sf9细胞进行诱导表达,利用层析柱和离子交换柱对表达产物进行纯化,并通过SDS-PAGE、Western blotting及四极杆静电场轨道阱高分辨质谱仪(Q Exactive)对目的蛋白进行分析验证。结果显示,本试验成功构建杆状病毒质粒MRJP2-Bacmid,转染至Sf9昆虫细胞并获得表达产物。SDS-PAGE和Western blotting验证结果表明,本研究成功利用昆虫细胞-杆状病毒表达系统表达出大小约为52 ku的MRJP2重组蛋白,且纯度较高;质谱分析结果显示,该重组蛋白匹配到蜜蜂蛋白质数据库中MRJP2的特异性肽段为39个,序列覆盖率为61%,且与MRJP2的匹配得分最高,进一步确认该重组蛋白为MRJP2。本研究利用昆虫细胞-杆状病毒表达系统成功表达出MRJP2,为后续该蛋白生物学功能的深入研究奠定了基础。