知母活性成分ZDY101调节M2受体mRNA稳定性的研究

目的探讨知母活性成分ZDY101对M2受体mRNA稳定性的调节。方法转基因细胞CHOm2在含ZDY101或溶媒的培养基中培养不同时间后,实时荧光定量PCR检测M2受体的mRNA水平;用放线菌素D抑制基因转录,测定M2受体mRNA的时相变化,求出其mRNA的半衰期,比较ZDY101组和溶媒组的差别。结果ZDY101作用一定时间后M2受体的mRNA水平高于对照组;ZDY101作用24h以上,ZDY101组M2受体的mRNA半衰期明显高于对照组。结论ZDY101能提高M2受体mRNA的稳定性,使细胞M2受体的mRNA含量升高,是ZDY101提高M2受体密度的重要机制之一。

人SDCT2β3′-非翻译区基因表达负调控序列对mRNA稳定性的影响

为探索人高亲和力钠离子依赖性二羧酸转运蛋白基因(high affinity sodium-dependent dicarboxylate transporter,SDCT2)3′端非翻译区是否在基因表达调控中起作用,首先通过生物信息学分析发现,在SDCT2βmRNA的3′端非翻译区内存在585nt的AU富含区(AU-rich region,AUR),其中包括3个AU富含元件(AU-rich element,ARE),然后将SDCT2β的AU富含区DNA片段插入报告基因GFP表达载体pcDNA-GFP的下游,构建pcDNA-GFP-AUR表达载体并转染HEK293、HKC和LLC-PK1细胞系,用Western blot和流式细胞仪检测细胞中GFP的表达水平.结果显示,SDCT2β的AU富含区序列可显著降低GFP的表达水平(P<0.01).利用放线菌素D阻断RNA转录后,每隔2h从稳定转染的HEK293细胞中提取总RNA,用RNA印迹分析GFP mRNA的稳定性.结果显示GFP-AURmRNA较GFP mRNA不稳定.这些结果提示,在SDCT2β3′非翻译区的AU富含区内存在基因表达负调控区,该区可降低mRNA的稳定性、促进mRNA的降解,从而在转录后水平调控基因的表达.

洛伐他汀抑制Rho激酶信号通路增强人内皮一氧化氮合酶mRNA稳定性

他汀类药物可上调内皮一氧化氮合酶(ENOS)的表达,并由甲羟戊酸(MVA)途径介导,但具体机制未完全阐明.本研究旨在探索洛伐他汀(LVT)上调ENOS表达的分子信号机制并明确同ENOS表达相关的顺式作用元件的定位.洛伐他汀通过减少细胞内固醇,如MVA和geranylgeranylpyrophosphate(GGPP),从而增加ENOS mRNA的稳定性.因GGPP是细胞内信号蛋白如Ras、RhoGTPase进行翻译后修饰和膜定位所必需的,因此很可能洛伐他汀的作用与细胞内信号途径有关.进一步的实验结果显示Rho激酶抑制剂hydroxyfasudil和细胞松弛素D均可在转录后水平上调ENOS mRNA表达,表明Rho途径介导的细胞骨架状态在ENOS mRNA降解率的调控中起一定作用.细胞转染实验证明调控ENOS mRNA降解的顺式作用元件位于其mRNA序列上的3'未翻译区(3'UTR)和相邻的编码区.其中调控GGPP介导ENOS mRNA稳定性的顺式作用元件位于序列的3 751～4 606位点间;而hydroxyfasudil通过位于3 751～4 468位点间的顺式作用元件稳定ENOSmRNA;细胞松弛素D通过位于3 904～4 188位点间的元件稳定ENOS mRNA.洛伐他汀可能通过抑制Rho激酶途径稳定ENOS mRNA,此过程由位于mRNA序列上3'UTR及相邻编码区的多样顺式作用元件介导.另外,细胞骨架的空间构造也可影响ENOS mRNA的稳定性,此过程由位于其mRNA序列编码区的顺式作用元件介导.本研究为转录子稳定性调控机制的进一步研究提供了有力根据,或许可为心血管疾病的治疗提供新的分子靶点.

细胞衰老过程中p16^(INK4)mRNA稳定性调控

细胞衰老是诸多与之相关的基因或信号分子在环境因素作用下表达或修饰改变引起功能改变的"加合"结果。已发现至少上百个基因与衰老相关,但关键衰老相关基因的作用不可或缺。关键衰老相关基因p16INK4对衰老的发生与维持极其重要,探讨其调控机制一直是衰老及相关领域的重要课题。近年来多项研究表明,转录后水平调控,特别是多因素参与的mRNA稳定性调控是细胞衰老过程中p16表达的重要决定因素。

RNA结合蛋白调节mRNA稳定性的作用机制

免疫稳态的维持涉及多种细胞因子的基因表达调控,其中在转录后水平对mRNA稳定性的调控起重要作用。ARE(AU-rich element)位于mRNA 3'UTR(非编码区),富含AU碱基,某些RNA结合蛋白通过识别结合ARE影响mRNA的稳定性。本文综合最新研究,概述了TTP、HUR等RNA结合蛋白对mRNA稳定性的调节机制及其在信号通路中的作用。

茶多酚对大黄鱼肌肉5个基因片段mRNA稳定性的影响

成功克隆并测序获得大黄鱼肌肉钙蛋白酶基因(Calpain-1、Calpain-2)、钙蛋白酶抑制酶基因(Calpastatin)和蛋白酶家族基因(MuRF-1、MuRF-2)等5个基因片段cDNA,提交Genbank数据库分别获得序列号及长度为:Calpain-1(GeneBank no.KF527412,506bp)、Calpain-2(GeneBank no.KF527413,425bp)、Calpastatin(GeneBank no.KF527409,724bp)、MuRF-1(GeneBank no.KF527410,401bp)和MuRF-2(GeneBank no.KF527411,474bp)。大黄鱼5个基因cDNA片段序列BLAST分析表明:Calpain-1与罗非鱼的同源性达89%,Calpain-2与庸鲽同源性达89%,Calpastatin与鲈鱼的同源性达94%,MuRF-1与大西洋鲑鱼同源性达82%,MuRF-2与罗非鱼同源性达84%。实时定量分析大黄鱼宰杀当天和冷藏期间肌肉中5个基因mRNA的稳定性,得到Calpain-1、Calpastatin、MuRF-1和MuRF-2基因mRNA具有相对稳定性,随着贮藏时间的延长,mRNA水平呈下降趋势,与贮藏时间呈显著负相关性。茶多酚(TP)对冷藏大黄鱼片的保鲜作用,部分原因是通过TP影响大黄鱼片相应mRNA稳定性,进而有效控制冷藏期间鱼肉的新鲜度。

石胆酸通过上调miR-21表达降低核受体PPARαmRNA的稳定性

目的探讨石胆酸在转录后水平对PPARαmRNA稳定性的调控。方法构建PPARα3'UTR荧光素酶报告基因载体并转染HepG2细胞,比较两种浓度石胆酸处理后荧光素酶活性的变化。结合生物信息学预测,确定石胆酸诱导下差异表达的miRNAs及其在3'UTR上的潜在结合位点,对结合位点进行突变(Mut1、Mut2和Mut1+Mut2),比较石胆酸处理后Mut1、Mut2和Mut1+Mut2荧光素酶活性的变化。利用Westernblot和RT-qPCR检测两种浓度石胆酸处理下信号通路的激活及其下游转录因子基因表达水平,比较不转染对照组和瞬时转染过表达转录因子的PPARα蛋白表达,确定参与石胆酸调控PPARαmRNA稳定性的信号通路和转录因子。结果与对照组相比,100μmol/L石胆酸诱导3'UTR1和3'UTR2片段荧光素酶活力均显著下降超过50%(P<0.01)。miRNAPCRarray筛选发现石胆酸诱导miR-21和miR-22差异表达,100μmol/L石胆酸诱导miR-21表达上调2.35倍(P<0.05)。定点突变3'UTR1中两个预测的miR-21位点,构建了Mut1、Mut2和Mut1+Mut2报告基因载体。相对于对照组,石胆酸下调3'UTR1荧光素酶活性51%,而Mut1、Mut2和Mut1+Mut2分别被下调37%、39%、13%。Westernblot显示石胆酸磷酸化ERK1/2,激活ERK1/2信号通路;100μmol/L石胆酸上调转录因子EGR1基因表达水平5.83倍(P<0.01);瞬时转染过表达EGR1显著下调PPARα蛋白水平(P<0.05)。结论石胆酸通过激活肝细胞中ERK1/2信号通路,诱导早期生长应答因子EGR1和miR-21的表达上调,使miR-21作用于3'UTR调控区,降低PPARαmRNA的稳定性,从而减少PPARα基因和蛋白表达水平。

mRNA结构及其稳定性的关系

mRNA结构与mRNA稳定性关系密切,mRNA稳定性与基因表达调控之间也有着紧密的联系。现从mRNA结构中所含的5'端帽结构、3'端poly(A)尾、5'非翻译区、3'非翻译区、编码区、富AU元件等方面综述了mRNA结构与mRNA稳定性之间的关系,为深入了解基因表达调控的分子机制提供理论基础。

炎症介质mRNA脱腺苷及稳定性的调控机制研究进展

炎症介质在急性呼吸窘迫综合征等疾病过程中有重要作用。炎症介质mRNA稳定性的调控是RNA调控的一个重要方面。mRNA稳定性调控是一种广泛存在而极为重要的转录后调控方式,mRNA稳定与否直接关系到相应炎症介质表达量的多少。mRNA脱腺苷化是众多mRNA降解起始的开始和限速步骤,直接决定了mRNA稳定性的高低。mRNA脱腺苷并降解的调控途径众多,目前已知的主要有富含AU序列介导、无义介导、微小RNA介导、主要编码区域决定簇介导的途径和mRNA的缓慢脱腺苷途径,在不同细胞、不同环境中占据主导地位的调控途径存在差异。

小麦苗期根系mRNA的稳定性分析

转录后调控是基因表达调控的重要方式,其中mRNA稳定性是转录后调控的有效途径之一.实验采用cDNA-AFLP技术,对小麦杂交种3338/2463与其亲本苗期根系中的mRNA稳定性进行了分析.结果显示,在所检测到的2995条带中,有96条的丰度经3′脱氧腺苷处理60min后在至少一个材料中表现为明显降低,占总数的3.21%,表明这些条带所代表的mRNA半衰期比较短,可能是不稳定mRNA.同源比对分析结果显示,在所鉴定出的74个编码不稳定mRNA的基因中,有30个与已知功能基因具有较高的同源性,其中既有转录因子和信号转导基因,还有一些结构基因,而其余44个为功能未知基因.比较分析发现,杂交种与亲本之间不稳定mRNA的比例没有显著差异,但是不同基因型之间不稳定mRNA的降解速度不同,其中WRKY和线粒体半ABC转运蛋白基因在杂交种中的下调表达可能与其mRNA在杂交种与亲本中的稳定性差异有关.

苏云金芽胞杆菌鲇泽亚种HD-133 cry1D和cry1 Ab mRNA含量及稳定性研究

苏云金芽胞杆菌鲇泽亚种菌株HD 1 3 3含有代表性的三种cry1类基因cry1Ab,cry1C和cry1D ,它们的表达量却明显不同。通过Northern杂交检测了菌株HD 1 3 3中基因cry1D和cry1Ab的mRNA含量及其稳定性。结果表明 :基因cry1DmRNA的形成比基因cry1Ab的mR NA滞后 3h ,且基因cry1D形成mRNA的量很低 ,产生过程很平稳 ,在芽胞形成中期比cry1AbmRNA低 3 7倍 ;cry1AbmRNA含量在芽胞形成前期高于后期 ,在后期仍能大量持续稳定地转录。cry1DmRNA的半衰期为 1 8min,而cry1AbmRNA的半衰期为 1 4min。尽管cry1DmRNA比cry1AbmRNA的半衰期更长 。

大黄鱼(Pseudosciaena crocea)Cathepsin L基因cDNA片段的克隆与稳定性研究

采用RACE-PCR和RT-PCR方法获得大黄鱼组织蛋白酶L(Cathepsin L)基因的cDNA中间片段,片段长度为773bp。BLAST分析显示,大黄鱼Cathepsin L基因cDNA片段与鱼的同源性最高达到95%,与斑马鱼同源性为80%。实时定量分析了大黄鱼Cathepsin L基因在宰杀当天和冷藏期间的mRNA水平,结果表明,大黄鱼0℃条件下冷藏0、5、10、15、20d肌肉中mRNA都具有相对稳定性,但是含量水平有差异并且是呈现下降趋势,宰杀当天的大黄鱼肌肉中Cathepsin L基因mRNA含量水平最高,与冷藏5、10、15、20d的Cathepsin L基因mRNA水平差异性极显著(P<0.01),冷藏5d的Cathepsin L基因mRNA水平与15、20d的水平也达到了极显著水平(P<0.01)。同时结果表明,在不同储藏时间Cathepsin L基因的mRNA含量水平与肌肉TPA和pH等也表现了高度的相关性,表明Cathepsin L基因的mRNA含量可以作为评价大黄鱼冷藏期间肉品质指标的可行性和准确性。

mRNA稳定机制在低氧反应基因表达调控中的作用

几乎所有生物的信使RNA稳定性都影响基因表达。而mRNA的稳定性除了由其本身的序列和识别该序列的结合蛋白共同决定外 ,还受特异性的顺式作用元件和mRNA结合蛋白的影响。真核细胞中有 3个独特的顺式作用元件 :富AU元件 (ARE)、茎环结构和富嘧啶结构 ,在mRNA稳定性调节中发挥重要作用。

体外构建合成成纤维细胞生长因子-1mRNA及其表达的初步研究

目的:参照m RNA稳定性理论,设计并体外转录合成具有一定稳定性的FGF1 m RNA,对其表达进行初步验证。方法:在p T7TS载体上加poly A、βglobin 3′、5′UTR,增加GC含量优化设计FGF1序列,并结合m RNA二级结构分析其稳定性,目的序列琼脂糖凝胶电泳及测序验证后,体外转录合成FGF1 m RNA,待浓度及片段大小验证后,行动物实验,通过ELISA法检测FGF1 m RNA表达。结果:二级结构分析显示,优化后FGF1序列稳定性更高;双酶切后琼脂糖凝胶电泳显示p T7TS-FGF1重组载体构建成功,测序验证正确;聚丙烯酰胺凝胶电泳显示合成m RNA大小正确。ELISA检测显示,实验组(92.48 pg/m L)小鼠血清中FGF1蛋白含量较对照组(13.59 pg/m L和15.54 pg/m L)明显升高,差异有统计学意义(P<0.01);对照组间FGF1蛋白含量接近,二者无统计学差别(P>0.05)。结论:成功构建并体外转录合成稳定的FGF1 m RNA,m RNA与鱼精蛋白结合后回输小鼠在体内成功表达。

N-乙酰基转移酶10通过催化赖氨酸残基和胞嘧啶碱基的乙酰化修饰在多种生物学过程和疾病中发挥作用

N-乙酰基转移酶10(N-acetyltransferase 10,NAT10)是一种具有乙酰基转移酶活性的核仁蛋白质,可催化蛋白质赖氨酸残基和RNA胞嘧啶碱基的乙酰化修饰。近年来,大量研究表明,这些乙酰化修饰在端粒酶活性调节、细胞基本且核心功能的调节、细胞胁迫响应、DNA损伤修复、细胞周期调控、核糖体RNA的生物学合成、mRNA稳定性及翻译效率的调节等多种生命活动中发挥重要作用,并且与人类癌症、Hutchinson-Gilford早衰综合症(Hutchinson-Gilford premature aging syndrome,HGPS)的发生、发展和预后密切相关。然而,关于NAT10的研究仍存在一些局限性,例如NAT10完整的结构以及这些结构对其功能的影响仍未知,由NAT10调控的细胞基本功能也尚不清楚,并且NAT10对人类癌症和HGPS发展的具体影响机制也待阐明。本文从NAT10的结构、酶活性、生物学功能及其在疾病中的作用进行了综述,并提出了目前研究的局限性,展望了未来的研究方向,以期为NAT10的相关研究提供参考。

盘基网柄菌分化逆转引起mRNA的快速降解及抗菌素对其影响

诺加拉霉素能有效封锁盘基网柄菌转录,放线菌酮和嘌呤霉素对抑制该菌蛋白合成有相近效力。盘基网柄菌分化发育后期积累的mRNAs,在细胞被分散(分化逆转)时,专一地被快速降解。诺加拉霉素、放线菌素D和柔红霉素合用稳定某些快速降解的mRNAs。放线菌酮稳定所有mRNAs。嘌呤霉素不能稳定后期mRNAs,且有促进降解作用。表明后期mRNAs的快速降解不需要新蛋白合成,分化逆转只增强了已有酶的作用。

RNA结合蛋白HuR在肿瘤中的作用

RNA结合蛋白(RNA-binding proteins,RBPs)是近年来发现的具有多种生物学作用的分子家族,其中,HuR属于胚胎致死异常视觉家族的RBPs,表达广泛。最初发现HuR与神经分化相关,通过与靶mRNA3'UTR的ARE结合,在转录后水平调控RNA的稳定性和蛋白表达。近年发现,HuR与细胞增殖、肿瘤相关的炎症和血管生成密切相关,提示HuR可能参与了肿瘤发生、发展和转移过程。因此,以HuR为靶点的抗肿瘤策略可能为将来的肿瘤治疗带来希望。

5’UTR与基因表达的关系

基因表达调控是生物体生长发育的一个重要环节,而5’UTR与基因表达的关系非常密切。5’非翻译区包含了保守的茎环结构参与转录后协同调控的生物路径。5’非翻译区主要参与翻译调节,影响转录后的各个阶段,包括mRNA的稳定,折叠和核糖体的相互作用。