紫色红曲霉Mrr2基因的过表达对桔霉素积累的影响

为研究红曲霉Mrr2基因对桔霉素代谢的作用,通过农杆菌介导遗传转化获得Mrr2过表达菌株,与野生型菌株相比,Mrr2过表达导致菌丝中桔霉素含量显著增加,洛伐他汀和色素含量均有不同程度增加。RT-qPCR结果显示,Mrr2过表达对其他桔霉素相关基因的表达有明显促进作用,推测Mrr2对桔霉素的合成和积累具有重要影响,进一步丰富和完善了桔霉素合成调控途径,为桔霉素的消减提供理论依据。

白念珠菌MRR2基因错义突变C1409A与氟康唑耐药的相关性

目的研究锌簇转录因子——多药耐药调节因子2(Mrr2)编码基因MRR2错义突变C1409A与白念珠菌氟康唑耐药的相关性。方法利用白念珠菌工程菌株SN152构建MRR2基因敲除菌株,通过一步法克隆及定点突变技术构建MRR2基因C1409A突变型表达质粒,再用高效醋酸锂转染法将质粒片段转染入MRR2基因敲除菌株,异位表达于ADE2位点以构建MRR2基因定点突变菌株。通过体外药物敏感性试验及实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)分析错义突变C1409A与氟康唑耐药的关系。结果氟康唑对MRR2基因C1409A定点突变的白念珠菌的最低抑菌浓度(MIC)较对工程菌株SN152的MIC增加4倍,CDR1表达上调约3倍。结论 MRR2基因错义突变C1409A可上调白念珠菌CDR1表达并介导白念珠菌对氟康唑的耐药。

不同状态下白念珠菌SAP2、MRR2与伊曲康唑耐药的关系

目的初步明确在浮游状态和生物膜状态下白念珠菌毒力因子SAP2和转录因子MRR2对伊曲康唑(ITR)耐药的影响。方法对10株伊曲康唑单耐菌株、10株氟康唑(FCA)/ITR/伏立康唑(VRC)全敏感菌株进行SAP2、MRR2基因测序,分析其基因突变对耐药的影响;通过倒置显微镜及激光共聚焦显微镜观察不同时段下白念珠菌生物膜的形成,并通过酶标仪测定其OD值判断生物膜形成能力与耐药的关系。RT-PCR分别对浮游状态及生物膜状态下临床分离白念珠菌进行SAP2及MRR2表达量的检测,研究二者表达水平与伊曲康唑耐药的关系,并对浮游及生物膜状态下MRR2Δ/Δ菌株SAP2表达量进行检测,进一步明确MRR2与SAP2的关系。结果通过基因测序发现,SAP2基因无错义突变,MRR2基因测序出现12个错义突变位点;通过RT-PCR发现在不同状态下,耐药菌株组SAP2[浮游/生物膜:(1.30±0.39)/(4.29±1.76)]和MRR2[浮游/生物膜:(0.95±0.14)/(1.77±0.80)]基因的表达量均高于敏感菌株组[SAP2浮游/生物膜:(0.80±0.48)/(2.59±0.93);MRR2浮游/生物膜:(0.49±0.32)/(0.98±0.64),P<0.05],在生物膜状态下两基因的表达水平SAP2(3.44±1.63)和MRR2(1.19±0.99)相比浮游状态下[SAP2/MRR2:(1.05±0.50)/(0.81±0.62)]均上调(P<0.05),且在浮游状态下,两基因之间有正相关关系(r=0.66,P<0.05),在浮游及生物膜状态下MRR2Δ/Δ菌株SAP2的表达[浮游/生物膜:(0.80±0.06)/(2.15±0.23)]相对于标准菌株ATCC11006[浮游/生物膜:(1.14±0.07)/(2.90±0.10)]均明显下调(P<0.05);通过倒置显微镜及激光共聚焦显微镜观察生物膜形成过程发现,所有菌株均形成了菌丝及孢子相互交错的生物膜,并通过测定其OD值发现,耐药菌株组生物膜形成能力(0.24±0.02)明显高于敏感组(0.15±0.02,P<0.001),MRR2Δ/Δ菌株的生物膜形成能力(0.12±0.12)明显低于标准菌株组(0.16±0.00,P<0.001)。结论伊曲康唑耐药可能与白念珠菌MRR2基因突变有关;在浮游状态和生物膜状态下SAP2和MRR2的高表达都可影响白念珠菌对伊曲康唑的耐药,MRR2高表达对SAP2可能存在正向调控关系,从而影响其耐药。

白念珠菌锌簇转录因子编码基因mrr2敲除与鉴定

目的:构建白念珠菌mrr2基因敲除菌株。方法 :通过长引物PCR方法及融合PCR方法,以SN152菌株基因组DNA、带有筛选标记的质粒DNA为模板构建基因敲除组件;再用高效醋酸锂转染法将敲除组件转染入SN152菌株,并在相应营养缺陷的筛选板上培养生长,再通过2次同源重组的策略敲除mrr2的2条等位基因。结果:成功构建白念珠菌mrr2基因敲除菌株。结论:融合PCR策略可高效、快速构建白念珠菌基因敲除菌株。以SN152菌株为亲本菌的mrr2基因敲除株的构建,为进一步研究白念珠菌耐药机制奠定基础。