不同单株叶籽银杏DNA甲基化水平与模式的MSAP分析

以叶籽银杏和普通银杏叶片为试材,利用EcoRⅠ和HpaⅡ/MspⅠ双酶切建立适合于叶籽银杏全基因组的甲基化敏感扩增多态性(MSAP)分析体系,在全基因组水平对11株叶籽银杏和1株正常银杏的胞嘧啶甲基化水平和模式进行评估。结果表明,从36对MSAP选扩引物中,选出14对MSAP引物组合,共扩增产生2766条清晰可辨且可重复的DNA条带,产生3种类型的甲基化条带。在全部扩增位点中,检测到叶籽银杏基因组CCGG序列的甲基化比率为26.42%～65.79%,正常银杏总甲基化率达30.79%,不同单株的叶籽银杏平均总甲基化率达38.61%,叶籽银杏甲基化事件的发生频率为11.27%～27.34%。方差分析显示不同单株间DNA甲基化水平差异极显著。主成分分析绘制的主分量散点图与聚类分析结果一致,不同单株的叶籽银杏可分为3大类。

不同单株叶籽银杏DNA甲基化MSAP分析

利用MSAP(甲基化敏感扩增多态性)技术对11株叶籽银杏的胞嘧啶甲基化水平和模式进行评估。结果表明,叶籽银杏基因组的CCGG序列中检测到36.86%～46.43%的DNA发生甲基化。本研究从36对选扩增引物中筛选出14对引物组合,共得到2879条清晰可辨的带,叶籽银杏总体平均DNA基甲基化水平为42.14%,甲基化模式以内侧胞嘧啶为主,其中,外侧胞嘧啶甲基化水平为11.90%～23.90%,内侧胞嘧啶甲基化水平为17.03%～28.37%。UPGMA聚类分析和主成分分析结果一致,不同单株的叶籽银杏可分为3大类。推断叶籽银杏的变异机制可能与DNA甲基化有关。

高山马铃薯脱毒苗DNA甲基化的MSAP分析

为了解脱毒对高山马铃薯试管苗DNA甲基化水平的影响,探究DNA甲基化在高山马铃薯脱毒后的作用,结合毛细管电泳检测技术对怀玉山高山马铃薯脱毒苗的基因组DNA甲基化进行MSAP分析。结果表明,怀玉山高山马铃薯常温继代带毒苗甲基化水平较高,经过玻璃化法超低温保存处理但未能脱毒时其甲基化水平有所下降,但甲基化仍处于较高水平,而常规茎尖培养脱毒和玻璃化法超低温疗法脱毒可明显降低试管苗的甲基化水平,且玻璃化法超低温疗法脱毒苗的甲基化水平更低。在怀玉山高山马铃薯超低温保存(未能脱毒)、茎尖常规培养脱毒和超低温疗法脱毒3个处理方式中,去甲基化模式和甲基化模式并存,但均以去甲基化模式为主要趋势,且在去甲基化模式的强弱依次为超低温疗法脱毒>茎尖常规培养脱毒>超低温保存(未脱毒)。本研究结果为怀玉山高山马铃薯脱毒苗的种质保存和规模化生产提供了一定的理论依据。

红芽芋超低温疗法脱毒苗基因组DNA甲基化的MSAP分析

对红芽芋超低温疗法脱毒苗的基因组DNA甲基化进行MSAP分析。结果表明,红芽芋超低温疗法脱毒苗总甲基化率提高10.27%,全甲基化率提高12.98%,但半甲基化率下降2.71%。红芽芋超低温疗法脱毒苗去甲基化模式和甲基化模式并存,但去甲基化模式高于甲基化模式,说明较多基因被激活。

桑树同源多倍体基因组DNA甲基化状态的MSAP分析

DNA甲基化被认为是研究同源多倍体表观遗传现象的最佳途径。以‘新一之濑’、‘陕桑305’和‘陕桑402’为材料,研究桑树同源多倍体基因组DNA甲基化水平及变化模式。共筛选出21对引物组合应用甲基化敏感扩增多态性技术(MSAP),‘新一之濑’、‘陕桑305’和‘陕桑402’分别检测到507、507和511个位点。结果表明:从总体上看,‘陕桑305’、‘陕桑402’的总甲基化水平与‘新一之濑’的差异不大;桑树多倍化后甲基化模式发生了大量调整,主要以去甲基化类型(B型)为主,其次是过或超甲基化类型(C型)。由此推测,桑树同源多倍体可能通过DNA甲基化,在基因组加倍后,重新调控基因表达,从而表现出优势农艺性状。

同基因型非洲堇不同开花表型间DNA甲基化状态的MSAP分析

采用72对MSAP选择性扩增引物分别对16个经双酶切后的非洲堇DNA样品进行全基因组甲基化分析,其中49对引物组合扩增出的条带清晰、丰富且重复性好.通过对所扩增出的带形进行分析发现,有近1/4的DNA其甲基化状态存在差异,其中包括同一个体中茎段和叶片之间以及同基因型不同个体之间在CCGG位点上的甲基化差异.结果表明,同一个体中叶片的甲基化水平高于茎段;同基因型不同个体中通过茎段扦插方式繁殖的后代,保持了母本组织中DNA的甲基化状态,而通过叶片扦插繁殖的后代DNA甲基化状态发生了重建,且后代叶片组织中的甲基化水平总体呈略下降的趋势.

高活力水稻种子萌发过程中DNA甲基化变化的MSAP分析

DNA甲基化是基因组DNA的一种主要表观遗传修饰形式,是调节基因组功能的重要手段。本实验采用MSAP方法分析,旨在研究高活力水稻种子萌发过程中的甲基化与去甲基化变化的规律,为研究种子的老化机理和种子的长期保存提供依据。结果表明:水稻种子萌发过程中,同时发生了甲基化与去甲基化作用,且去甲基化作用先于甲基化作用发生。发生去甲基化可能与基因活化有关,发生甲基化可能与组织特异性有关。

利用MSAP分析18个芥蓝齐口期的表观遗传多样性

本研究利用MSAP检测18个芥蓝齐口期DNA甲基化水平,分析了表观遗传多样性,探讨DNA甲基化模式对齐口期的影响。结果表明,18个芥蓝齐口期平均为50d,叶片数平均为10片,齐口期和叶片数不相关（相关系数为0.296）;变异系数分别为21%和18%;遗传距离分布在0~40,平均值为12.2276,在10.62处分为3类。MSAP分析表明,5对引物组合扩增得到432条多态性条带,201条片段表现出多态性,多态性比率为47%;Nei遗传距离分布在0.004~0.467,平均值为0.0958,表明遗传多样性水平较低;在0.04处分为3类。Mantel测验表明两种分析的遗传距离相关系数为-0.1366,显示齐口期、叶片数与DNA甲基化多态性没有相关性。DNA甲基化模式分析表明,非甲基化片段为110条,甲基化多态性片段为322条,分为3种带型,类型一为非甲基化带型（110条）,类型二为甲基化带型（110条）,类型三为半甲基化带型（152条）,非甲基化片段和半甲基化片段在不同品种之间呈现多态性,甲基化片段在不同品种之间呈现多态性与单态性相差不大,显示MSAP多态性主要来源于非甲基化和半甲基化片段,芥蓝甲基化模式以半甲基化为主。本文推测DNA甲基化水平降低参与芥蓝齐口期调控,MSAP分析既可用于基因组结构研究,又可用于基因组水平上性状的功能研究。

黄独冻后培养胚性愈伤组织DNA甲基化的MSAP分析

本研究利用MSAP技术来探明黄独冻后培养胚性愈伤组织DNA甲基化模式和水平的变化。结果表明,黄独冻后黑暗培养胚性愈伤组织DNA甲基化模式可分为四大类。类型A包含三个亚类,未发生DNA甲基化模式改变的类型占35.48%。类型B包含五个亚类,32.26%位点的DNA发生过甲基化。类型C也包含五个亚类,29.03%的位点发生DNA去甲基化,DNA甲基化水平下降。类型D包含两个亚类,DNA甲基化状态未知,位点数目不超过总检测位点的4%。冻后黑暗培养胚性愈伤组织和冻后光周期胚性愈伤组织的甲基化敏感扩增多态性分别为107.69和120.83,全甲基化率分别为88.46%和95.83%,半甲基化率分别为19.23%和25.00%。因此,在黄独胚性愈伤组织冻后黑暗培养过程中发生了较高程度的去甲基化,最终导致其DNA甲基化水平下降。本实验结果为从表观遗传学的角度解释冻后黑暗培养修复黄独胚性愈伤组织超低温保存伤害的机理提供了帮助。

不同钾离子浓度处理影响烟草DNA甲基化变化的MSAP分析

烟叶钾含量是评定烤烟品质的重要指标之一,它与烟叶的燃烧性、降低危害物质、增强烟叶的香吃味等密切相关。本试验以钾元素富集能力较强的烟草为材料,采用不同的钾离子浓度处理烟苗,研究不同钾离子浓度对DNA甲基化变化的影响,试验结果表明,0、15 mmol/L、30 mmol/L、45 mmol/L和60 mmol/L硝酸钾浓度处理烟苗的总甲基化比例为33.26%、32.82%、29.20%、28.94%和27.43%,全甲基化比率为22.45%、22.17%、19.47%、19.43%和17.71%。随着钾离子处理浓度的增高,甲基化条带比率、全甲基化条带百分比均逐渐降低,DNA甲基化的变化可能是烤烟幼苗调控基因表达响应钾胁迫的方式之一。

高温胁迫下水稻基因组DNA表观遗传变化MSAP分析

目的:研究高温胁迫对水稻基因组DNA甲基化变化的影响,筛选出一批与高温胁迫的相关基因,研究DNA基因化与基因转录水平之间的关系。方法:在人工气候箱子中,对四叶期的水稻幼苗进行38度高温处理,分别取0 h、2 h、4 h、8 h、12 h、16 h和24 h七个不同时间点的幼叶提取DNA与RNA,利用MSAP技术检测总甲基化水平变化,RT-PCR检测相关基因的转录本的表达量变化。结果:与对照组0 h幼叶相比,高温处理下的2 h、4 h、8 h、12 h、16 h和24 h幼叶的总体甲基化水平依次是37.14%、36.79%、36.00%、35.50%、35.43%、34.64%和34.57%,可知幼叶DNA甲基化水平在高温处理后不断降低。此外,RT-PCR结果显示筛选的两个与甲基化相关的基因(PP2C和RAFP)的转录水平与甲基化水平呈负相关。结论:基因组甲基化作为一种重要的表观遗传调控方式,可以通过调控相关的基因的表达量水平来防御高温胁迫。

木薯不同发育期块根基因组DNA甲基化变化分析

DNA甲基化在植物的转座子沉默和基因表达调控中起着重要的作用。本研究以淀粉含量差异较大的两个木薯种质SC5和Cas36-12为研究材料,采用甲基化敏感扩增多态性(MSAP)技术,通过LabChip GX Touch微流控毛细管电泳系统分析其块根发育过程中的甲基化变化情况。结果表明:14对选择性扩增引物在SC5和Cas36-12中分别扩增出345和339个甲基化条带,SC5三个发育期的甲基化率高于Cas36-12,且都超过50%。比较SC5和Cas36-12块根发育3个关键时期的甲基化变化情况,发现两份材料甲基化变化的整体趋势是一致的。形成期到膨大期主要以发生甲基化为主;而膨大期到成熟期主要以去甲基化为主。

玛瑙红樱桃离体快繁及组培苗的变异检测

以贵州玛瑙红樱桃的休眠芽为外植体,通过不同激素质量浓度组合的正交试验,建立了高效的离体培养体系;利用ISSR分子标记,对组培苗的遗传变异进行检测,结果表明:在引物检测范围内,玛瑙红樱桃离体快繁至第8代仍然能保持其遗传稳定性;DNA甲基化的MASP分析表明,组培苗的甲基化敏感多态性随继代次数的增加而逐步升高,第5代组培苗总甲基化率最高,为21.4%,全甲基化率为12.4%,半甲基化率为9.0%.

嫁接对橡胶树砧木甲基化水平的影响

选择IAN873、GT1、RRIM600三品种实生树作为接穗,IAN873、GT1、RRIM600播种移栽苗为砧木,用MSAP方法对嫁接前后砧木的甲基化水平进行分析。结果表明,对砧木进行嫁接后发生了甲基化变化,且IAN873接穗引起砧木的甲基化变化大于GT1和RRIM600接穗引起的变化;砧木嫁接后,甲基化变化主要以半甲基化与无甲基化间的相互转换为主,而由半甲基化转化为全甲基化或者由全甲基化转换为半甲基化的很少,全甲基化与无甲基化间的转换居中。

湿地松×洪都拉斯加勒比松及亲本DNA胞嘧啶甲基化的初步研究

以湿地松×洪都拉斯加勒比松(Pinus elliottii×P.caribaea var.hondurensis)及亲本为实验材料,采用甲基化敏感扩增多态性技术对其基因组中CCGG位点的甲基化相对水平及遗传变异模式进行了初步分析。结果表明,杂种及亲本CCGG总甲基化相对水平介于77.74%~81.75%,CG甲基化相对水平略低于CNG甲基化水平,CG/CNG甲基化相对水平高于亲本。杂种遗传自亲本的CG与CNG甲基化位点数之比接近1∶1,遗传自母本的甲基化位点数与遗传自父本的CCGG甲基化位点数比例为1∶1;杂种产生的全新甲基化与完全去甲基化位点数之比接近7∶1,初步推测大量甲基化变异促进了杂合体的生长发育。

不同色相‘富士’苹果解袋后着色过程中DNA甲基化的差异分析

以十四年生‘富士’苹果为试材,采用甲基化敏感扩增多态性(methylation sensitive amplified polymorphism,MSAP)技术,研究了不同色相‘富士’苹果解袋后12 d着色期内果皮DNA全基因组甲基化变化,以探讨‘富士’苹果着色与其果皮DNA全基因组甲基化的关系。结果表明:Ⅱ型甲基化(外侧胞嘧啶半甲基化/CGH甲基化)、Ⅲ型甲基化(内侧胞嘧啶全甲基/CG甲基化)在解袋第6天明显出现一个拐点,甲基化水平和甲基化模式变异在2个着色期(前6 d为S1期,后6 d为S2)变化明显,甲基化水平明显降低,甲基化模式前期以甲基化为主,后期则以去甲基化为主。可见,去甲基化在解袋后‘富士’苹果着色期可能发挥了重要作用;条红和全红2种色相‘富士’苹果研究结果显示,DNA的甲基化水平及模式变化条红‘富士’更为明显。该研究可为不同色相富士苹果的鉴定,以及富士苹果的选育,着色的调控提供新的思路。