鸡TGFβ1对MDCC-MSB1细胞增殖、凋亡、迁移与侵袭的影响

旨在探讨鸡TGFβ1对MDCC-MSB1细胞增殖、凋亡、迁移与侵袭的影响。作者将构建的鸡TGFβ1过表达载体、干扰表达载体以及相应阴性对照转染MDCC-MSB1细胞,然后检测转染后各组细胞鸡TGFβ1的表达水平、细胞增殖能力、细胞周期与凋亡,细胞的迁移与侵袭能力。结果显示,与相应阴性对照相比,转染TGFβ1过表达质粒可显著上调MDCC-MSB1细胞的TGFβ1表达水平,显著抑制MDCC-MSB1细胞的增殖,且使G1期细胞增加、S和G2期细胞减少,同时增加细胞凋亡率,降低细胞的迁移与侵袭能力;转染TGFβ1干扰表达质粒可显著下调MDCC-MSB1细胞的TGFβ1表达水平,显著促进MDCC-MSB1细胞的增殖,G1期细胞减少、S和G2期细胞增加,同时降低细胞凋亡率,增加细胞的迁移与侵袭能力。结果表明,鸡TGFβ1可抑制MDCC-MSB1细胞增殖、迁移与侵袭,促进其凋亡。

gga-miR-155对MDCC-MSB1细胞生物学行为的影响

为了解gga-miR-155对MDCC-MSB1细胞生物学行为的影响,将人工合成的gga-miR-155模拟物、gga-miR-155抑制物以及阴性对照瞬时转染MDCC-MSB1细胞。然后采用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测MDCC-MSB1细胞中gga-miR-155的表达水平,CCK-8法检测转染后细胞增殖能力的变化,流式细胞术检测MDCC-MSB1细胞的细胞周期与凋亡的变化,Transwell检测MDCC-MSB1细胞的迁移、侵袭能力的变化。结果显示,gga-miR-155模拟物可显著上调MDCC-MSB1细胞gga-miR-155表达水平,促进MDCC-MSB1细胞增殖,细胞G1期细胞减少,S和G2期细胞增加,同时凋亡减少,迁移、侵袭能力增加;gga-miR-155抑制物可显著下调MDCCMSB1细胞gga-miR-155表达水平,抑制MDCC-MSB1细胞增殖,细胞G1期细胞增加、S和G2期细胞减少,同时凋亡增加,迁移、侵袭能力下降。结果表明,gga-miR-155可促进MDCC-MSB1细胞增殖、迁移和侵袭,抑制其凋亡。

鸡p15因子抑制MDCC-MSB1细胞的增殖及端粒酶活性

为探讨鸡p15基因的生物学功能,试验构建了鸡p15基因的真核表达载体pcDNA3.1(+)-p15,并转染到鸡MDV转化的淋巴细胞系MDCC-MSB1,应用G418筛选掉未转染的细胞,对存活细胞p15蛋白的表达、细胞增殖力、群体倍增时间、细胞周期和端粒酶的活性进行了检测。结果表明,与转染空质粒pcDNA3.1(+)细胞相比,转染了p15基因的细胞稳定表达了p15蛋白;细胞的增殖受到了抑制,抑制率达45%～74%;群体倍增时间从27h延长至416h;流式细胞仪分析细胞周期发现,p15蛋白引起了细胞多停滞于G0/G1期,S和G2/M期细胞比例下降;端粒酶活性受到抑制。

硝酸镧对MDCC-MSB1细胞形态及细胞周期的影响

以体外培养的MDCC-MSB1细胞为研究对象,分别经终浓度为0、8、32、64μg/mL的硝酸镧作用24、48、72 h后,采用台盼蓝染色测定细胞活性,荧光显微镜观察细胞的形态学变化,流式细胞术测定细胞周期。研究了硝酸镧对鸡MD肿瘤细胞株MDCC-MSB1细胞形态及细胞周期的影响,进而探讨硝酸镧对MDCC-MSB1细胞的影响机制。结果表明,硝酸镧能够降低MDCC-MSB1的细胞活性,能够引起典型的凋亡形态学变化及细胞周期的改变,并呈现细胞凋亡的细胞型,变化均呈现时间-剂量效应。证实,一定浓度的硝酸镧具有诱导体外培养MDCC-MSB1细胞凋亡的作用。

鸡传染性贫血病病毒在MDCC-MSB1细胞的传代致弱研究

为研究鸡传染性贫血病(Chicken infectious anemia,CIA)减毒活疫苗,试验将鸡传染性贫血病病毒(CIAV)在鸡淋巴细胞MDCC-MSB1上进行37℃和40℃传代致弱。结果显示:40℃条件下传至60代和37℃下传至90代,病毒的VP1氨基酸分别有2个和3个突变,两种条件下有2个突变是在同一位置;VP2和VP3很稳定,在试验中未发生氨基酸突变;致病性试验发现,突变毒株仍具有致病性,但有降低的趋势。试验表明,鸡淋巴细胞传代CIAV可以引发包含中和抗原表位的VP1突变,且提高温度能促进变异速度,为进一步研究CIAV的变异特征、弱毒疫苗研发提供了参考依据。

MDCC-MSB1细胞酵母双杂交cDNA表达文库的构建与鉴定

提取生长状态良好的MDCC-MSB1细胞的mRNA,以5′端标记有生物素的Oligo dT primer为引物反转录,合成双链后连接Adapter。分级纯化后,通过BP重组反应构建入门文库,滴度为1×105 CFU/mL,文库总容量为1.1×106 CFU,平均插入片段长度为1190bp,阳性重组率为100%。入门文库扩增后提取质粒,通过LR重组反应转化为表达文库,平均滴度为1×105 CFU/mL,文库总容量为1.2×106 CFU,平均插入片段长度为1087bp,重组率为100%。构建的表达文库具有较高的质量,为研究鸡传染性贫血病毒的受体及其细胞嗜性奠定了基础。

gga-miR-155对MDCC-MSB1细胞转录组的影响

旨在探讨gga-miR-155对马立克病病毒转化的肿瘤细胞系MDCC-MSB1细胞转录组水平变化的影响。本研究以MDCC-MSB1细胞为研究对象,首先将gga-miR-155模拟物及其阴性对照转染MDCC-MSB1细胞,在转染后48 h提取总RNA,用安捷伦2100核酸检测仪分析各组细胞总RNA的完整性,采用RT-qPCR分析gga-miR-155在MDCC-MSB1细胞中的过表达情况;然后利用高通量测序技术,分析gga-miR-155过表达后MDCC-MSB1细胞转录水平的变化,筛选差异表达基因,结合生物信息学分析预测差异表达基因中gga-miR-155靶mRNA。结果显示:制备了gga-miR-155在MDCC-MSB1细胞过表达样本并构建了高通量测序文库;与对照组相比,gga-miR-155过表达组的差异表达基因有87个,其中,上调表达的基因有47个,下调表达的基因有40个;GO与KEGG分析显示,这些差异表达基因显著富集于代谢和蛋白结合过程/信号通路;通过Targetscan和miRada软件预测下调表达基因中鸡BACH1为gga-miR-155的靶mRNA(P<0.05)。综上,过表达gga-miR-155可调控MDCC-MSB1细胞的转录组水平,差异表达基因中BACH1基因可能在gga-miR-155的作用下参与了MDCC-MSB1细胞的代谢过程。

鸡RORα真核表达载体的构建及其在MSB1细胞中的表达

为构建鸡维甲酸相关孤核受体α(retinoid acid receptor related orphan receptorα,RORα)的真核表达载体,并检测其在MSB1细胞中的表达效果,本研究参照GenBank中鸡RORα基因序列(登录号:NM_001289887.1)设计特异性引物,从鸡肝脏组织中提取总RNA,经反转录合成cDNA,以此为模板进行PCR扩增,将扩增的特异性RORα基因片段连接pMD18-T载体,构建克隆载体pMD18-T-RORα,再用SalⅠ和BamHⅠ双酶切克隆载体pMD18-T-RORα和真核表达载体pEGFP-N1,将酶切回收的RORα与pEGFP-N1片段进行连接,构建重组真核表达载体pEGFP-N1-RORα,经PCR、酶切和测序验证准确性后,将其转染MSB1细胞,于转染后48h荧光显微镜下观察EGFP的表达情况,并采用实时荧光定量PCR检测鸡RORα在MSB1细胞中的表达水平。结果显示,从构建的重组质粒pEGFP-N1-RORα中可扩增出大小约1 600bp的特异性片段,用SalⅠ和BamHⅠ可切出大小约4 700和1 600bp的两条带。实时荧光定量PCR结果显示,转染MSB1细胞48h后,与对照组相比,重组真核表达载体转染组中鸡RORα基因mRNA水平显著增加(P<0.05)。表明本试验成功构建了鸡RORα的真核表达载体,该载体可在MSB1细胞中表达鸡RORα,为进一步研究鸡RORα对MSB1细胞增殖的影响奠定基础。

拯救鸡传染性贫血突变株对宿主细胞生长周期及凋亡的影响

通过流式细胞术,观察拯救鸡传染性贫血病毒突变株(CIAVM突变株)对宿主细胞MSB1的生长周期及凋亡的影响。拯救CIAVM突变株接于MDCC-MSB1细胞系,并相应设立阴性组(正常SPF鸡肝脏细胞液),阳性组(CUX-1标准毒株),进行培养24～48h。用PI及FITC Annexin V染色方法,用流式细胞仪测定宿主细胞生长周期及凋亡,并用SPSS13.0进行结果统计学分析。接种拯救CIAV M突变株的宿主细胞G0/G1期的累积细胞百分率为(59.33±4.04)%,S期为(32.92±3.65)%,G2/M期为(7.75±3.11)%,与阴性组相比,G0/G1期细胞累积百分率有所上升;与CUX组相比,G0/G1期有所下降,但结果经统计学分析,差异均不显著(P>0.05)。试验组宿主细胞凋亡率为(37.00±4.65)%,与阴性组相比,凋亡率上升,统计学差异显著(P<0.05);与阳性组相比,凋亡率下降,统计学差异显著(P<0.05)。试验结果显示,经过VP3基因突变的CIAV M突变株,经过病毒拯救并回归SPF鸡后,对宿主细胞MSB1的生长周期没有显著的抑制,但能引起宿主细胞的显著性凋亡,且凋亡程度与CUX-1引起的宿主细胞凋亡率相比有所降低。可以表明,通过VP3密码子移位的基因突变,能够将CIAV的致凋亡作用降低,从而相应降低病毒的致病性,为以后构建CIAV减毒疫苗株奠定理论基础。

沙冬青生物碱对MDCC-MSB1细胞增殖抑制与诱导凋亡的影响

采用体外细胞培养技术、噻唑蓝(MTT)还原法、透射电子显微镜观察及流式细胞技术检测梯度浓度沙冬青总生物碱对体外培养鸡马立克氏病肿瘤HDCC-MSB1细胞的增殖抑制及诱导凋亡的作用。结果显示,沙冬青生物碱可显著抑制HDCC-MSB1细胞增殖,且这种抑制具有剂量和时间效应关系。经沙冬青生物碱作用的HDCC-MSB1细胞培养样本中有明显的DNA低含量颗粒("亚G1期"峰),细胞周期各时相分布发生改变,细胞增殖在G1被阻滞,并进一步诱导HDCC-MSB1细胞凋亡。电子显微镜观察也表明,经沙冬青生物碱作用的HDCC-MSB1细胞培养样本中,大量HDCC-MSB1细胞凋亡。结果表明,沙冬青生物碱对HDCC-MSB1细胞增殖有显著抑制效应,其抑制机理为诱导HDCC-MSB1细胞凋亡。

沙冬青生物碱对MDCC-MSB1端粒酶活性和细胞凋亡的影响

采用单管法一步完成端粒重复序列扩增(TRAP)方法检测沙冬青总生物碱(50、100、150及200μg/mL)对体外培养的鸡马立克氏病肿瘤HDCC-MSB1细胞株作用前后端粒酶活性变化的影响,并采用流式细胞仪检测细胞凋亡和周期的改变。结果显示,沙冬青生物碱可显著抑制HDCC-MSB1细胞的端粒酶活性,且这种抑制有剂量和时间效应关系。同时,经沙冬青生物碱作用的HDCC-MSB1细胞培养样本中有明显的DNA低含量颗粒("亚G1期"峰),细胞周期各时相分布发生改变,细胞增殖在G1被阻滞。上述结果表明,沙冬青生物碱对HDCC-MSB1细胞端粒酶活性具有显著的抑制效果,并进一步诱导了细胞凋亡。

沙冬青生物碱对MDCC-MSB1细胞增殖及细胞线粒体膜电位的影响

采用体外细胞培养技术、噻唑蓝(MTT)还原法、流式细胞技术检测梯度浓度沙冬青总生物碱对体外培养鸡马立克氏病肿瘤HDCC-MSB1细胞株的增殖抑制及对线粒体膜电位的影响。结果显示,沙冬青生物碱可显著抑制HDCC-MSB1细胞增殖,且这种抑制具有剂量和时间效应关系。经沙冬青生物碱作用的HDCC-MSB1细胞培养样本中有明显的DNA低含量颗粒("亚G1期"峰),细胞周期各时相分布发生改变,细胞增殖在G1被阻滞。细胞线粒体膜电位(△Ψm)明显下降,也呈现出剂量和时间效应关系。结果表明,沙冬青生物碱对HDCC-MSB1细胞增殖有显著抑制效应,且抑制依赖于诱导HDCC-MSB1细胞线粒体膜电位(△Ψm)的下降,并进一步诱导了该细胞的凋亡。