骨髓间充质干细胞经慢病毒转染绿色荧光蛋白后的体内观察

目的:观察经慢病毒转染绿色荧光蛋白(green fluorescence protein,GFP)的骨髓间充质干细胞(bonemarrow mesenchymal stem cells,BMSCs)移植注入兔椎间盘后的荧光时效性。方法:体外培养并纯化BMSCs,并用含有GFP标记的重组慢病毒载体(Lentivirus-GFP)转染后移植入兔椎间盘,在移植后2、4、6、8、10、12周用激光共聚焦显微镜观察BMSCs荧光强度及细胞增殖情况,考察慢病毒转染GFP体内荧光维持时间。结果:经慢病毒转染GFP后的BMSCs,荧光显微镜下48 h开始显现绿色荧光,72 h荧光亮度达到最高。植入体内后8周内均能用激光共聚焦显微镜观察到绿色荧光,8周后荧光强度开始逐渐减弱,第2、4、6、8、10、12周6个时间点GFP-BMSCs的阳性率分别是(21.75±1.32)%、(33.07±3.53)%、(33.20±3.60)%、(29.90±4.23)%、(19.64±2.93)%和(10.91±3.43)%。结论:BMSCs在椎间盘微环境中能够稳定增殖,用慢病毒转染GFP的方法能在至少8周内可靠示踪其在椎间盘内的存活状态,8周后荧光强度开始逐渐减弱。

GFP标记干细胞修复椎间盘退变中的示踪研究

目的探讨绿色荧光蛋白(GFP)示踪时效及GFP标记的骨髓间充质干细胞(MSCs)在移植后参与退变修复过程中的细胞增殖情况。方法使用针吸髓核法建立兔的椎间盘退变模型,体外培养MSCs,并用含有绿色荧光蛋白标记的腺病毒载体(Adeno-XTM-GFP)转染,成为GFP标记的MSCs(GFP-MSCs),于造模2周后植入造模的椎间盘内。在移植后第2、4、6、8周用激光共聚焦显微成像技术,观察MSCs的增殖情况,对比GFP本身荧光和免疫荧光的示踪时间。结果非免疫荧光组GFP本身荧光强度能够持续到4周,后较微弱甚至难以辨别;免疫荧光组用FITC荧光二抗标记的GFP-MSCs在8周内都能够持续稳定的显现荧光,4个时间点GFP-MSCs的阳性率的可信区间分别是:2周(14.64±2.05)%;4周(21.85±2.45)%;6周(31.03±4.03)%;8周(36.37±4.42)%。结论GFP-MSCs在椎间盘微环境中能够稳定增殖。若示踪研究需要持续超过4周,则应对GFP行免疫荧光染色,可以使有效示踪时间持续至少8周。

移植骨髓间充质干细胞对兔退变椎间盘髓核细胞凋亡的影响

目的 观察骨髓间充质干细胞（MSCs）移植对兔退变椎间盘髓核细胞凋亡的影响.方法 以各兔L2/3、L3/4、L4/5、L5/6节段分为正常组、退变组、成纤维细胞（SFs）移植对照组、MSCs移植治疗组.MSCs和SFs分别经绿色荧光蛋白（GFP）转染后,注射植入退变椎间盘的髓核.通过透射电镜观察退变椎间盘凋亡髓核细胞形态 用实时定量聚合酶链反应（PCR）检测退变组织中髓核细胞凋亡相关基因bcl-2和box mRNA的表达 免疫荧光法标记髓核细胞凋亡相关蛋白Caspase-3,并通过TUNEL法标记凋亡髓核细胞,激光共聚焦显微镜检测髓核细胞凋亡蛋白表达率和细胞凋亡比率.结果 透射电镜下,退变椎间盘中凋亡髓核细胞呈现出核染色质边集,空泡形成,核膜断裂,凋亡小体形成等变化.MSCs移植治疗组bcl-2 mRNA的表达量高于退变组和SFs移植对照组（P〈0.05）,bax mRNA的表达量与退变组差异无统计学意义（P〉0.05）.MSCs移植治疗组细胞凋亡率和Caspase-3表达率均高于正常组[细胞凋亡率分别为（16.75±2.14）%和（6.86±1.08）% Caspase-3表达率分别为[（20.34±1.03）%和（6.09±0.77）%]（P〈0.05）,低于退变组和SFs移植对照组[细胞凋亡率分别为（31.87±4.16）%和（29.02±2.16）% Caspase-3表达率分别为（31.50±3.78）%和（30.20±4.93）%]（P〈0.05）.结论 髓核细胞凋亡在椎间盘退变过程中起重要作用.MSCs移植能有效抑制椎间盘髓核细胞凋亡,延缓椎间盘退变过程.