二氢杨梅素通过α-MSH/MITF通路抑制黑色素生成的研究

目的:评价二氢杨梅素(DMY)对小鼠黑色素瘤细胞B16的影响,并揭示其抑制黑色素产生的作用机制。方法:CCK8法筛选DMY对B16细胞增殖活性影响的最佳浓度。分为对照组、模型组(α-MSH)阳性药组(α-MSH+熊果苷)、给药组(α-MSH+DMY),采用CCK8法测定不同组别B16细胞的增殖活性,ELISA法检测B16细胞中黑色素和酪氨酸酶的含量,透射电镜观察细胞中黑素小体数量,分子对接法预测DMY降低黑色素含量作用的蛋白,免疫荧光法和Western blot分别测α-MSH和MITF蛋白的表达。结果:DMY抑制B16细胞增殖的最佳浓度为62.5μmol·L^(-1)。最佳浓度下,与模型组相比,DMY可以抑制B16细胞的增殖,降低黑色素和酪氨酸酶含量,减少黑素小体数目,抑制α-MSH和MITF蛋白表达。结论:二氢杨梅素通过调节α-MSH/MITF通路抑制B16细胞产生黑色素。

胃癌组织中MLH1,MSH2,MSH6和PMS2表达及与临床病理特征和预后的相关性分析

目的探讨胃癌组织中错配修复蛋白MutL homologue 1(MLH1),MutS homologue 2(MSH2),MutS homologue 6(MSH6)和减数分裂后分离为2(postmeiotic segregation increased 2,PMS2)的表达及与临床病理特征和预后的相关关系。方法选取承德医学院附属医院病理科2018年11月~2021年11月确诊的474例胃癌组织为研究对象,采用免疫组织化学SP法检测胃癌组织中MLH1,MSH2,MSH6和PMS2蛋白表达水平,根据此四种蛋白表达情况将胃癌组织分为高频微卫星不稳定(microsatellite instability-high,MSI-H)组和低频微卫星不稳定或微卫星稳定(microsatellite instability-low/microsatellite stability,MSI-L/MSS)组,比较两组的临床病理特点。采用Kaplan-Meier生存分析法比较两组患者的预后情况。结果474例胃癌中,MSI-L/MSS型胃癌为403例(85.02%),MSI-H型胃癌共71例(14.98%)。其中4种错配修复蛋白MLH1,MSH2,MSH6和PMS2任一表达缺失共42例,占8.86%(42/474);两种及以上蛋白表达缺失共29例,占6.12%(29/474);MLH1,MSH2和PMS2同时表达缺失率0.84%(4/474);MLH1,MSH2,MSH6和PMS2全部表达缺失率0.21%(1/474)。MSI-H型胃癌患者淋巴结转移率和脉管侵犯率低于MSI-L/MSS型胃癌,差异具有统计学意义(χ^(2)=21.65,8.93,均P<0.05)。而两组患者在性别、年龄、Borramn分型、Lauren分型、分化程度、浸润深度和远处转移等方面比较,差异均无统计学意义(χ^(2)=0.03~2.79,均P>0.05)。MSI-H型与MSI-L/MSS型胃癌患者相比,三年总生存率(overall survival,OS)为87.52%和62.68%,差异无统计学意义(χ^(2)=3.64,P>0.05),三年无进展生存率(progression-free survival,PFS)为75.00%和57.84%,差异无统计学意义(χ^(2)=3.21,P>0.05)。结论与MSI-L/MSS型胃癌相比,MSI-H型胃癌患者淋巴结的转移率低和脉管的侵犯率低,三年OS和PFS偏高,提示MSI-H型胃癌患者有较好的预后。

结、直肠癌中错配修复蛋白MLH1、PMS2、SH2、MSH6的表达及与其临床病理特征的关系分析

目的检测结、直肠癌(CRC)患者中错配修复基因(MMR)各错配修复蛋白(MLH1、PMS2、MSH2、MSH6)的表达,分析各错配修复蛋白缺失与其临床病理特征的关系。方法选取结、直肠癌632例,采用免疫组化方法,检测MHL1、PMS2、MSH2、MSH6的表达,将4种MMR蛋白中的一种或一种以上的表达缺失判定为错配修复基因缺陷(dMMR),4种蛋白全部为阳性则判定为错配修复基因完整(pMMR)。结果632例CRC中,pMMR组552例,占87.5%;dMMR组80例,占12.6%。dMMR组中,蛋白MLH1、PMS2、MSH2、MSH6的表达缺失率分别为7.1%、15.6%、8.4%及21.9%,未发现四个蛋白全部缺失者。其中MLH1-PMS2共同缺失表达类型为27例(4.3%)、MSH2-MSH6共同缺失表达类型15例(2.4%),经统计学分析两者均呈正相关(γs=0.631,P<0.001;γs=0.824,P<0.001)。结、直肠癌患者dMMR与pMMR在发病年龄、肿瘤部位和淋巴结转移方面存在明显差异(P<0.01),而在性别、肿瘤大小以及癌胚抗原等肿瘤标志物等方面无明显差异(P>0.05)。结论错配修复基因(MMR)各蛋白的缺失与结、直肠癌临床病理特征有密切的关系。根据错配修复基因(MMR)各蛋白的缺失可以将结、直肠患者分为不同的亚群并可作为对各亚群的临床治疗药物的选择以及疗效的预测依据。对错配修复基因的进一步的研究有助于揭示结、直肠癌的发病机制及指导未来治疗的方向。

敲低错配修复基因MSH6抑制结直肠癌细胞上皮间充质转化及其增殖

目的:探究错配修复基因MSH6对结直肠癌细胞的增殖、迁移和侵袭的影响及可能发生的机制。方法:根据美国国家生物信息技术中心(NCBI)中MSH6的基因序列构建靶向敲低MSH6的序列shMSH6-1、shMSH6-2和shMSH6-3,采用细胞转染技术敲低结直肠癌细胞中MSH6的表达,通过实时荧光定量PCR检测敲低效率并进行慢病毒包装,应用Western blot在细胞系中筛选MSH6高表达细胞系进行后续实验,应用CCK8检测细胞增殖能力,克隆形成实验检测细胞集落形成能力,伤口愈合和Transwell法检测细胞迁移和侵袭能力,通过Western blot方法检测上皮间充质相关蛋白的表达变化。结果:MSH6在结直肠癌细胞系中表达上调,其中RKO、SW620、LOVO细胞系上调明显,敲低MSH6明显限制了结直肠肿瘤细胞的增殖、迁移和侵袭,同时导致E-cadherin蛋白水平增加,N-cadherin和Vimentin蛋白表达下降。结论:MSH6在结直肠癌中表达上调,敲低MSH6可抑制结直肠癌细胞的增殖、迁移和侵袭,诱导细胞发生凋亡并能够逆转EMT的发生。

活血祛斑方治疗黄褐斑的临床疗效观察及其对血清MSH、ET-1、NO、VEGF的影响

目的:观察活血祛斑方治疗黄褐斑的临床疗效及对血清促黑素(MSH)、内皮素-1(ET-1)、一氧化氮(NO)、血管内皮生长因子(VEGF)的影响。方法:选取2019年4月—2022年4月在常山县人民医院医疗服务共同体和衢州市人民医院就诊的黄褐斑患者104例,根据抽签法随机分为对照组和观察组,各52例;另选取健康体检者30例做健康对照。对照组给予维生素C片口服治疗,观察组给予活血祛斑方治疗,治疗3个疗程评定疗效。治疗前后对皮损面积、皮损颜色、中医兼证症状进行评分,检测血清MSH、ET-1、NO、VEGF水平,统计6个月复发情况况。结果:治疗3个疗程后,观察组有效率较对照组提高(P<0.05)。与健康组相比,对照组和观察组治疗前MSH、ET-1、NO水平升高(P<0.05),VEGF水平降低(P<0.05);治疗后对照组和观察组较治疗前MSH、内皮素-1、NO水平均降低(P<0.05),VEGF水平升高(P<0.05);与对照组治疗后比较,观察组治疗后MSH、ET-1、NO水平下降(P<0.05),VEGF水平升高(P<0.05)。两组治疗后皮损面积、皮损颜色、中医兼证症状评分低于治疗前(均P<0.05);观察组较对照组皮损面积、皮损颜色、中医兼证症状评分降低明显(均P<0.05)。结论:活血祛斑方治疗黄褐斑临床疗效显著,能够改善患者临床症状,降低血清MSH、ET-1、NO水平,提高VEGF水平。

miR-149-5p通过MSH5/Wnt信号通路调控胶质瘤细胞恶性生物学行为

目的探索miR-149-5p调控MSH5/Wnt信号通路影响胶质瘤细胞恶性生物学行为的具体作用机制。方法RT-qPCR检测miR-149-5p在胶质瘤组织和细胞系A172、U251、HS683、H4中的表达。CCK-8检测细胞活力,EDU染色检测细胞增殖,Transwell小室检测细胞的迁移和侵袭,流式细胞术检测细胞周期和细胞凋亡。双荧光素酶报告基因实验验证miR-149-5p和MSH5的靶向关系。Western blot检测MSH5、GAPDH、GSK3β、β-catenin、AXIN2的蛋白表达。结果miR-149-5p在胶质瘤组织(P<0.0001)和细胞系中表达降低(P<0.0001),过表达miR-149-5p可显著抑制A172细胞的增殖(P<0.01)、迁移(P<0.05)和侵袭(P<0.01)、细胞周期(P<0.01),并诱导凋亡(P<0.01),敲降miR-149-5p则具有相反的作用。双荧光素酶报告基因实验证明miR-14-5p靶向MSH5。敲降miR-149-5p可逆转敲降MSH5对A172细胞恶性生物学行为的作用。过表达MSH5通过抑制GSK3β、激活β-catenin/AXIN2通路,促进A172细胞的增殖、迁移和侵袭和细胞周期,并抑制细胞凋亡。结论miR-149-5p通过靶向上调MSH5,抑制AXIN2表达激活β-catenin/AXIN2通路,从而抑制间质瘤细胞的恶性生物学行为。

α-MSH调控Bcl-2线粒体途径在桃红四物汤防治激素性股骨头坏死中的作用机制

目的探讨α-MSH调控Bcl-2线粒体途径在桃红四物汤防治激素性股骨头坏死中的作用机制。方法SD大鼠臀肌注射甲泼尼龙琥珀酸钠构建激素诱导相关的股骨头坏死大鼠模型;灌胃给予桃红四物汤干预;并以臀肌注射生理盐水的大鼠为对照。给药8周后取材,体外诱导培养成骨细胞,观察CCK-8,DAPI染色,Western blotting免疫蛋白印迹方法分析α-MSH调控Bcl-2的蛋白表达水平。结果CCK-8检测α-MSH对原代成骨细胞的细胞毒性较低,CCK-8检测α-MSH对激素诱导的原代成骨细胞凋亡显示较强的抗凋亡作用(P<0.05);激素诱导后的原代成骨细胞活力受到抑制,但是α-MSH对激素诱导的原代成骨细胞未显示出明显的促进细胞活力的作用。WB检测相关凋亡指标未显示出明显的α-MSH对激素诱导的原代成骨细胞凋亡的抗凋亡作用。DAPI观察激素处理后可见部分细胞核变小,说明激素可能诱导成骨细胞的凋亡,但是α-MSH未显示出明显的抗凋亡作用。结论α-MSH调控Bcl-2线粒体途径在桃红四物汤防治激素性股骨头坏死中的作用机制,为临床诊疗股骨头坏死提供新的研究思路,并值得进一步探讨其分子机制。

山羊MSH4和MSH5基因的cDNA克隆、序列分析及组织表达

以低繁藏山羊和高繁金堂黑山羊为研究对象,分别提取处于发情期的5只藏山羊和5只金堂黑山羊的卵巢、子宫、输卵管、垂体的总RNA,并通过RT-PCR技术对MSH4、MSH5基因c DNA进行克隆、序列分析,以Real-time PCR技术对其进行组织表达研究。结果表明,藏山羊和金堂黑山羊MSH4基因编码区均长2 499 bp,编码832个氨基酸,两品种基因编码区有5处碱基不同,并导致3处氨基酸的差异;MSH5基因编码区均长2 496 bp,编码831个氨基酸,两品种基因编码区有9处碱基不同,并导致5处氨基酸的差异。藏山羊MSH4基因编码区核苷酸序列与金堂黑山羊、山羊、绵羊、牛、马、小鼠、褐家鼠、人的同源性分别为:99.8%、99.8%、99.4%、98.1%、94.4%、85.1%、84.7%和93.5%;藏山羊MSH5基因编码区核苷酸序列与金堂黑山羊、山羊、牛、家犬、小鼠、褐家鼠、人的同源性分别为:99.6%、99.6%、97.3%、88.0%、85.8%、85.3%和90.2%。MSH4和MSH5基因m RNA在两个山羊品种的卵巢、子宫、输卵管、垂体中均有表达,但两品种间无显著性差异(P>0.05)。说明MSH4和MSH5基因在动物进化中比较保守,与山羊多羔性状的相关性有待进一步研究。

丹参素对糖尿病肾病大鼠Notch1/免疫球蛋白κJ区重组信号结合蛋白/Msh同源异型基因2信号通路及钙磷代谢的影响

目的探讨丹参素通过调控Notch1/免疫球蛋白κJ区重组信号结合蛋白(RBP-Jκ)/Msh同源异型基因2(Msx2)信号通路对糖尿病肾病大鼠钙磷代谢的影响。方法2019年10月至2020年4月,北京维通利华实验动物科技有限公司购入SD大鼠,采用高糖高脂饲养4周、腹腔注射链脲佐菌素(STZ,40 mg/kg)建立糖尿病肾病大鼠模型。建模后按随机数字表法分为模型组、丹参素(低、中、高)剂量组(2.5 mL·kg^(-1)·d^(-1)、5.0 mL·kg^(-1)·d^(-1)、10.0 mL·kg^(-1)·d^(-1))、糖适平组(阳性对照,9.45 mL·kg^(-1)·d^(-1)),每组10只;对照组10只大鼠基础饲料饲养。给予相应的药物连续灌胃4周,1次/天。实验结束,观察大鼠一般情况;血糖仪检测空腹血糖(FBG)水平;24 h尿微量白蛋白(24 h尿mALB)试剂盒检测24 h尿mALB水平;全自动生化分析仪检测血清中钙、磷水平;苏木精-伊红(HE)染色检测大鼠肾脏组织形态;Von Kossa染色检测大鼠肾主动脉钙盐沉积情况;蛋白免疫印迹检测大鼠肾脏组织中Notch1、RBP-Jκ、Msx2、Jagged1、Notch1基因的胞内域(N1-ICD)蛋白水平。结果给药前,与对照组相比,造模组大鼠的FBG、24 h尿mALB水平升高(P<0.05)。给药后,模型组大鼠精神萎靡、活动减少,反应迟钝、眼神无力,多饮多食、排尿量增加、垫料易潮湿;出现肾小球肥大、基膜增厚现象,组织纤维化、炎症浸润明显;肾主动脉血管内膜、中膜弹性纤维间出现大量黑色颗粒,血管钙化严重。丹参素(低、中、高)给药组随着剂量的增加,大鼠活动逐渐恢复正常,反应迟钝减少,但仍有多饮多食、排尿量增加、垫料易潮湿现象;肾小球肥大、基膜增厚缓解,组织纤维化消失、炎症缓解;肾主动脉血管内膜、中膜弹性纤维间黑色颗粒减少,血管钙化稍缓解。与对照组相比,模型组FBG、24 h尿mALB水平,血清中钙[(2.89±0.14)mmol/L比(2.24±0.09)mmol/L]、磷[(3.48±0.28)mmol/L比(2.49±0.21)mmol/L]、钙×磷[(126.29±13.16)mg2/dL2比(71.06±13.48)mg2/dL2],肾脏组织中Notch1[(1.06±0.15)比(0.31±0.06)]、RBP-Jκ[(1.15±0.03)比(0.37±0.04)]、Msx2[(0.69±0.05)比(0.23±0.04)]、Jagged1、N1-ICD蛋白水平升高(P<0.05);与模型组相比,丹参素低剂量组24 h尿mALB水平,血清中钙、磷、钙×磷,肾脏组织中Notch1,RBP-Jκ、N1-ICD蛋白水平降低,丹参素(中、高)剂量组、糖适平组FBG、24 h尿mALB水平,血清中钙、磷、钙×磷,肾脏组织中Notch1、RBP-Jκ、Msx2、Jagged1、N1-ICD蛋白水平降低(P<0.05)。结论丹参素可通过调控Notch1/RBP-Jκ/Msx2信号通路发挥对糖尿病肾病大鼠钙磷沉积现象的改善。

α-黑素细胞刺激素(α-MSH)对羊驼皮肤黑素细胞增殖和黑素生成的影响

旨在研究α-黑素细胞刺激素(α-Melanocyte stimulating hormone,α-MSH)对羊驼皮肤黑素细胞(Melano-cyte,MC)增殖和黑素合成的影响。体外培养正常羊驼皮肤黑素细胞,观察不同浓度α-MSH(0、10-9、10-8、10-7mol·L-1)对羊驼皮肤黑素细胞增殖、黑素含量、表皮黑皮素-1受体(Melanocortin1receptor,MC1R)基因、小眼畸形相关转录因子(Microphthalmia-associtated transcription factor,MITF)和酪氨酸酶(Tyrosinase,TYR)基因表达量的影响。结果表明,α-MSH处理羊驼皮肤黑素细胞3d后,羊驼皮肤黑素细胞增多,黑素含量、MC1R和TYR基因表达量都明显增加(P<0.05),以10-8mol·L-1组最为显著,MITF基因表达量也明显增加(P<0.05),以10-7mol·L-1组最为显著。α-MSH能诱导羊驼皮肤黑素细胞增殖、树突增长、黑素合成增加、MC1R、MITF和TYR基因表达量增高。

α-MSH对家兔ET性发热反应及脑腹中隔区AVP含量的影响

目的：研究脑腹中隔区精氨酸加压素（ＡＶＰ）在α－黑素细胞刺激素（αＭＳＨ）解热机制中的作用。方法：建立家兔ＥＴ性发热模型，观察侧脑室注射α－ＭＳＨ对家兔ＥＴ性发热反应及脑腹中隔区ＡＶＰ含量的影响。结果：（１）静脉注射ＥＴ（０３μｇ／ｋｇ）引起家兔明显的发热反应（Ｐ＜０００１），并增加脑腹中隔ＡＶＰ含量（Ｐ＜００５）；（２）静脉注射ＥＴ（０３μｇ／ｋｇ）３０ｍｉｎ后，侧脑室注射α－ＭＳＨ（２００ｎｇ／只），能明显抑制家兔发热反应，同时脑腹中隔区ＡＶＰ含量进一步显著增高（Ｐ＜０００１）；（３）侧脑室注射α－ＭＳＨ（２００ｎｇ／只）并不影响家兔正常体温，但增加脑腹中隔区ＡＶＰ含量（Ｐ＜００５）。结论：α－ＭＳＨ的解热作用可能部分是通过腹中隔ＡＶＰ增多来实现的，αＭＳＨ可能是引起发热时脑腹中隔区ＡＶＰ含量增加的一个重要因素。

散发性结直肠癌组织中FHIT、MSH2蛋白的异常表达及其临床意义

背景与目的:脆性组氨酸三联体(fragilehistidinetriad,FHIT)蛋白表达缺失是胃肠道肿瘤的频发事件,但在大肠癌却有争议;最近研究表明FHIT蛋白表达失活可能是错配修复蛋白,尤其是mutS同种组织蛋白2(mutShomolog2,MSH2)改变的结果。本研究旨在探讨FHIT、MSH2蛋白在散发性结直肠癌(sporadiccolorectalcarcinoma,SCC)组织中的表达情况及其临床意义。方法:采用免疫组化SP法检测手术切除的84例SCC及其对应癌旁正常结直肠组织和23例肠腺瘤组织标本中FHIT、MSH2蛋白的表达。结果:FHIT蛋白在SCC组织、结直肠腺瘤组织、癌旁正常结直肠组织中阳性率分别为48.81%、73.91%和100%,三者的阳性率差异有显著性(P<0.05)。FHIT蛋白表达水平与SCC患者的年龄、性别及肿瘤部位、组织学类型无关(P>0.05),而与肿瘤浸润深度、分化程度、Dukes分期和淋巴结转移有关(P<0.05),在浸润深度越深、分化程度越低、Dukes分期越晚和有淋巴结转移的癌组织中,FHIT蛋白低表达就越明显;而MSH2蛋白表达水平仅与Dukes分期有关(P<0.05)。SCC中FHIT蛋白表达与MSH2蛋白表达呈正相关(r=0.3728,P<0.01)。结论:(1)FHIT蛋白表达水平与SCC的恶性程度有关,可作为预测SCC浸润转移潜能的一项有意义的生物学指标;(2)SCC中FHIT、MSH2蛋白表达二者之间呈正相关。

DAB_(389)(Gly_4Ser)_2αMSH重组融合蛋白的构建及表达

利用含有白喉毒素N端序列的基因作上游引物、含有αMSH全序列和(Gly4Ser)2互补序列的基因作下游引物,以pET28a/DAB389(Gly4Ser)2EFG为模板,PCR扩增DAB389(Gly4Ser)2αMSH基因片段,用限制性内切酶EcoR和Nco酶切,并插入原核表达载体pET28a的相应位点,构建了重组表达载体pET28a/DAB389(Gly4Ser)2αMSH,在大肠杆菌中表达重组融合蛋白DAB389(Gly4Ser)2αMSH,转化菌经IPTG、30℃诱导5h,用SDS-PAGE和Western blot鉴定表达的重组蛋白。结果表明扩增的片段与理论值一致。重组质粒的DNA序列分析正确。SDS-PAGE表明,重组蛋白相对分子质量为45870,且表达量达菌体总蛋白量的29.2%。Western blot分析显示,重组蛋白能特异地与抗白喉抗体结合。成功构建表达了重组DAB389(Gly4Ser)2αMSH的工程菌株,表达产物具有生物学活性。

α-MSH对脂多糖诱导小鼠腹腔巨噬细胞CD14和TLR4 mRNA表达的影响

目的 :观察α -黑色素细胞刺激素 (α -MSH)对脂多糖 (LPS)诱导小鼠腹腔巨噬细胞CD14和TLR4mRNA表达的影响 ,探讨α-MSH拮抗LPS的作用机制。方法 :用半定量逆转录多聚酶链反应 (RT -PCR)的方法检测LPS诱导体外培养的小鼠腹腔巨噬细胞CD14和TLR4mRNA表达水平和给予α -MSH后对CD14和TLR4mRNA表达的影响。结果 :正常静息小鼠腹腔巨噬细胞只表达少量的CD14和TLR4mRNA ,给予LPS刺激后 6h ,两者表达明显强于正常对照 (P <0 . 0 1) ,并且其表达量随着LPS刺激时间的增加维持在高水平 ,2 4h达到峰值 ,在 4 8hCD14mRNA的表达降到正常水平 ,而TLR4mRNA的表达仍然维持在高水平。在LPS刺激的同时给予α -MSH ,CD14和TLR4mRNA的表达则明显低于LPS组 (P <0 .0 5 ) ,而且α-MSH这种效应与其使用浓度有关 ,0 .1nmol/Lα -MSH不影响LPS诱导的CD14和TLR4mRNA的表达 ,而当α -MSH的浓度达到 1、10、10 0nmol/L则能显著影响CD14和TLR4mRNA的表达(P <0 . 0 5 ) ,但各个浓度组之间的作用没有明显差别 (P >0 .0 5 )。结论 :α -MSH抗LPS的效应可能与其下调LPS信号转导通路关键受体CD14和TLR4mRNA的表达有关 ,从而干扰LPS跨膜信号转导 ,阻碍巨噬细胞活化。

错配修复基因hMSH2在宫颈腺癌组织中的表达

目的 :探讨hMSH2基因在人宫颈腺癌组织中的表达及其临床意义。方法 :应用免疫组化链霉菌抗生物素蛋白 过氧化物酶连接法检测 36例宫颈腺癌组织中错配修复基因hMSH2蛋白的表达。结果 :36例宫颈腺癌组织中 10例hMSH2呈阴性 (2 8% ) ,2 6例为阳性表达 (72 % ) ,且与肿瘤分化程度相关 ,分化程度越低阳性率越低 (P <0 .0 5 ) ,hMSH2的表达与肿瘤组织学类型和FIGO分期未见明显关系 (P >0 .0 5 )。结论 :hMSH2基因与宫颈腺癌的发生。

lpa-miR-nov-66通过调控cAMP路径抑制α-MSH介导的羊驼黑色素生成

α-黑素细胞刺激素(α-MSH)和lpa-miR-nov-66在羊驼黑色素细胞产生黑色素过程中均起重要的调控作用,但二者之间的关系尚未报道.本研究在体外培养的羊驼黑色素细胞中通过转染lpamiR-nov-66和添加α-MSH处理,用实时定量PCR和Western印迹检测黑色素细胞内基因表达水平,ELISA法检测c AMP和cGMP的产量,RTCA实时无标记细胞功能分析黑色素细胞增殖以及紫外分光光度法检测黑色素产量,证实二者在调控羊驼黑色素细胞产生黑色素颗粒过程中的关系.结果显示,与单纯α-MSH处理相比,lpa-miR-nov-66转染结合α-MSH处理组中,小眼转录因子(MITF)和酪氨酸酶(TYR)在转录水平和翻译水平的表达均降低,而酪氨酸酶相关蛋白2(TYRP2)在转录和翻译水平的表达均升高;cGMP的产量升高,cAMP的产量下降;黑色素细胞增殖没有显著变化;黑色素细胞内黑色素产量下降.与单纯转染lpa-miR-nov-66相比,lpa-miR-nov-66转染结合α-MSH处理组中,MITF、TYR和TYRP2在转录水平和翻译水平的表达均升高;cGMP的产量下降,cAMP的产量升高;黑色素细胞增殖没有显著变化;黑色素细胞内黑色素产量升高.上述结果证明,lpa-miR-nov-66通过调控羊驼黑色素细胞中毛色形成的c AMP路径,抑制α-MSH对黑色素细胞产生黑色素的促进作用.

急性胰腺炎患者外周血α-MSH IL-2 TNF-α及IFN-γ的动态检测及临床意义

目的探讨急性胰腺炎(AP)患者外周血α-黑色素细胞刺激素(α-MSH)、白细胞介素-2(IL-2)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)及γ干扰素(IFN-γ)含量的动态变化及其评估病情严重程度的临床意义。方法选取2016年1月至2018年1月安徽医科大学第二附属医院急诊外科收治的AP患者60例,轻症组30例、非轻症组30例,另选取30例健康志愿者作为对照组。所有患者在入院后第1、3、7天取静脉血,采取酶联免疫吸附法对α-MSH、IL-2、TNF-α及IFN-γ含量进行测定。结果入院后第1、3、7天轻症组、非轻症组血清α-MSH含量总体逐渐下降,且非轻症组α-MSH含量一直较低;各时间点非轻症组α-MSH含量均明显低于轻症组,同时两组患者第1、3、7天α-MSH含量明显低于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。入院后第1、3、7天轻症组、非轻症组血清IL-2含量逐渐上升,且非轻症组IL-2含量一直较高;各时间点非轻症组IL-2含量均明显高于轻症组,同时两组患者第1、3、7天IL-2含量明显高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。入院后第1、3、7天轻症组、非轻症组血清TNF-α含量逐渐上升,且非轻症组TNF-α含量一直较高;各时间点非轻症组TNF-α含量均明显高于轻症组,同时两组患者第1、3、7天TNF-α含量明显高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。入院后第1、3、7天轻症组、非轻症组血清IFN-γ含量总体逐渐下降,且非轻症组IL-γ含量一直较低;各时间点非轻症组IFN-γ含量均明显低于轻症组,同时两组患者第1、3、7天IFN-γ含量明显低于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。α-MSH、IL-2、TNF-α、IFN-γ及四者联合的曲线下面积分别为0.769、0.697、0.691、0.688及0.886。结论AP患者外周血α-MSH、IL-2、TNF-α及IFN-γ含量在评估患者病情严重程度方面具有不同程度的临床意义,外周血α-MSH在病情评估方面的敏感度、特异度及准确性均高于另外的三个指标,患者较低的外周血α-MSH含量表明患者病情严重,预后较差,四个指标联合检测在评估病情严重程度方面存在更佳的临床价值。

DAB_(389)(Gly_4Ser)_2-αMSH重组蛋白的构建表达及特异性细胞毒性研究

目的:构建重组毒素DAB389(Gly4Ser)2-αMSH,探讨其对过度表达αMSH受体的几种癌细胞的特异杀伤作用。方法:利用含有His.Tag和白喉毒素的基因序列作上游引物、含有αMSH全序列和(Gly4Ser)2的互补序列基因作下游引物,以pET28a-DAB389(Gly4Ser)2-EGF为模板,PCR扩增得到DAB389(Gly4Ser)2-αMSH片段,插入原核表达载体pET28a的相应位点,构建重组表达载体并在大肠杆菌中表达重组融合蛋白DAB389(Gly4Ser)2-αMSH。用SDS-PAGE和Western blot鉴定表达的重组蛋白,用结晶紫法检测重组蛋白对几种癌细胞和正常细胞的毒性作用。结果:构建了含有His.Tag重组表达质粒pET28a-DAB389(Gly4Ser)2-αMSH;SDS-PAGE表明,重组蛋白相对分子质量为45.32×103,其表达量占菌体蛋白总量的29.2%;Western blot分析显示,重组蛋白能特异地与抗白喉抗体结合;细胞活性检测表明重组蛋白对SP2/0,HeLa,A549,A375这4种癌细胞有明显的杀伤作用,4种癌细胞的IC50值分别是3.138,2.736,7.243和4.672μg.mL-1。结论:成功构建了具有生物学活性的重组蛋白DAB389(Gly4Ser)2-αMSH,为进一步的靶向性药物研究奠定了基础。

α-MSH对EGTA性发热效应及脑腹中隔AVP含量的影响

目的和方法：观察脑腹中隔精氨酸加压素（ＡＶＰ）在α－黑素细胞刺激素（α－ＭＳＨ）解热机制中的作用；用放射免疫法测定ＡＶＰ含量。结果：ＥＧＴＡ引起明显的发热反应（Ｐ＜０．０１），同时降低脑腹中隔ＡＶＰ含量（Ｐ＜０．０５）。α－ＭＳＨ可抑制ＥＧＴＡ性发热反应（Ｐ＜０．０１），并增加脑腹中隔ＡＶＰ含量（Ｐ＜０．０５）；而对正常家兔体温及脑腹中隔ＡＶＰ含量无影响（Ｐ＞０．０５）。结论：α－ＭＳＨ对ＥＧＴＡ的解热作用可能部分是通过增加脑腹中隔ＡＶＰ的释放而实现的。在限制发热的过程中，内生解热物α－ＭＳＨ与ＡＶＰ可能具有协同作用。

miR-186-5p与α-MSH互作对绵羊黑素细胞黑色素生成的影响

黑色素合成受多种基因和miRNAs的调控,为了研究miR-186-5p与α-MSH协同作用对绵羊黑素细胞黑色素生成的影响。本研究在绵羊黑素细胞中转染miR-186-5p表达载体,同时添加α-MSH,通过实时荧光PCR (quantitative real time polymerase chain reaction, qRT-PCR)和蛋白质免疫印迹(Western blotting)检测MITF、TYR、TYRP1和TYRP2 4种可能与之相关的基因表达情况;利用免疫组化检测MITF蛋白在黑素细胞中的表达和亚细胞定位;通过分光光度法测定黑色素含量变化;利用划痕试验测定细胞迁移情况,试验分为miR-186-5p转染组、miR-186-5p+α-MSH互作组和对照组,每组3个重复。结果显示,miR-186-5p能够抑制绵羊黑素细胞中MITF、TYR、TYRP1和TYRP2的表达,并最终抑制黑色素的生成。而添加α-MSH能缓解miR-186-5p对MITF、TYR、TYRP1和TYRP2表达的抑制作用,进而在一定程度上恢复黑色素的含量。另外,miR-186-5p还能抑制细胞分裂,并阻碍细胞的迁移,而α-MSH无法抵消miR-186-5p产生的这种负面影响。上述结果表明,在绵羊黑素细胞中,miR-186-5p和α-MSH均参与调控黑色素合成途径,其中,miR-186-5p主要起负调控作用,而α-MSH主要参与相关位点的正调控,并能部分恢复miR-186-5p导致的黑色素含量下降。值得注意的是,miR-186-5p还参与调控细胞的增殖和迁移,而α-MSH不参与相关调控。