MSMEG_6171在耻垢分枝杆菌中的表达及多组学关联分析

目的筛选MSMEG_6171在耻垢分枝杆菌中的可能调控通路或基因,并进行验证。方法构建MSMEG_6171基因过表达的耻垢分枝杆菌株和空载质粒对照菌株;对其转录组和蛋白质组进行验证并深入挖掘MSMEG_6171过表达调控的下游信号网络;qRT-PCR验证差异表达基因。结果成功构建了MSMGE_6171过表达的耻垢分枝杆菌菌株(Msm::6171);转录组和蛋白质组数据的对比分析发现有38个基因在转录水平和蛋白表达水平显著上调,有31个基因表达水平显著下调;差异表达基因主要参与甘油酯代谢,核糖体和代谢通路;15个候选基因实时荧光定量PCR验证结果与转录组和蛋白质组测序分析趋势一致。结论MSMGE_6171调控了多个靶向基因,参与代谢和核糖体通路,为深入研究MSMGE_6171的调控网络提供了新的认识和重要参考。

MSMEG_0372基因敲除、回补及过表达耻垢分枝杆菌的构建与鉴定

目的为研究MSMEG_0372基因的功能,构建该基因敲除、回补及过表达耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis,M.smegmatis)并鉴定。方法聚合酶链反应(PCR)扩增MSMEG_0372基因的左、右臂(即等位基因互换底物,allele exchange substrates,AES)。AES与p0004s经过酶切并连接,构建p0004s-AES质粒。p0004s-AES与phAE159经过酶切并连接,构建phAE159-AES噬菌粒。噬菌粒转化至M.smegmatis,30℃培养,扩增重组噬菌体。用重组噬菌体侵染M.smegmatis,37℃培养,发生基因同源重组,形成MSMEG_0372基因敲除菌株。筛选阳性菌落,PCR鉴定。PCR扩增MSMEG_0372基因,构建pMV361-MSMEG_0372质粒。将pMV361-MSMEG_0372质粒分别导入MSMEG_0372基因敲除菌株和野生型M.smegmatis,构建MSMEG_0372基因回补菌株和MSMEG_0372基因过表达菌株。筛选阳性菌落,PCR鉴定。结果PCR扩增出MSMEG_0372的左、右臂(AES),构建了p0004s-AES质粒和phAE159-AES噬菌粒,制备了高滴度的重组噬菌体并侵染M.smegmatis,从而成功构建了MSMEG_0372基因敲除菌株。构建了pMV361-MSMEG_0372质粒,成功构建了MSMEG_0372基因回补和过表达菌株。结论成功构建并鉴定了MSMEG_0372基因敲除、回补及过表达M.smegmatis,为进一步研究该基因的功能奠定了基础。

敦煌卷子S.6171中“文王”考

敦煌卷子S.6171自从发现以来,引起了许多学者的研究兴趣。然而,由于原卷的残损不全以及文字的缺漏,使得各家对它的研究成果皆限于文本的梳理,而对其诗中所述内容、写作时代则未深入探究。本文则通过将S.6171卷中第十五首诗歌中所谈及的“文王”与唐代史料加以印证,进而得出此卷中所言文王即为唐太宗贞观二十二年入唐为质子之“新罗文王”的结论,从而推知本诗所述之时代背景当在高宗朝。

耻垢分枝杆菌MSMEG_4259的基因组维护功能研究

MSMEG_4259基因及其同源基因广泛存在于分枝杆菌属中。蛋白序列分析显示,MSMEG_4259包含DEDDh核酸外切酶结构域以及一个类似UvrC的核酸内切酶结构域,提示其可能参与DNA修复。为了探究MSMEG_4259的生理功能,本研究利用同源重组方法在耻垢分枝杆菌(Mycolicibacterium smegmatis)构建了MSMEG_4259基因敲除(ΔMs4259)菌株,并采用波动试验测定菌株在对数生长期以及H2O2处理后的利福平耐药突变频率。结果显示,ΔMs4259菌株的利福平耐药自发突变频率较野生型菌株升高1.9倍(P<0.05),该表型能够通过表达MSMEG_4259回补。测定耐药突变菌株rpoB基因的耐药决定区域序列,发现ΔMs4259菌株的A:T>C:G突变概率较野生型菌株上升约10倍,有研究证明该突变谱是DNA氧化损伤的常见突变。实时荧光定量聚合酶链反应(real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction, qRT-PCR)结果显示,野生型菌株的MSMEG_4259表达在H2O2处理后上调约7倍,提示该基因在转录水平参与了氧化压力应答。野生型菌株与ΔMs4259菌株在氧氟沙星、叔丁基过氧化氢和紫外线处理下的存活率无显著差异,提示MSMEG_4259不参与耻垢分枝杆菌对上述DNA损伤剂的耐受。本研究初步揭示了MSMEG_4259参与耻垢分枝杆菌基因组维护的生理功能、突变谱及转录调控等特性,为进一步研究其同源基因在结核分枝杆菌致病和耐药中的作用机制奠定了基础。

高速低功耗低失真运算放大器LM6171原理及应用

ＬＭ６１７１是美国国家半导体公司采用先进的ＶＩＰＴＭⅢ（垂直集成ＰＮＰ）互补双极性工艺最新设计、生产的运算放大器，特别适用于高速信号的处理。

耻垢分枝杆菌MSMEG_6281过表达对菌株生长和形态的影响

【目的】耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis mc2155,mc2155)MSMEG_6281为结核分枝杆菌自溶素Rv3717的同源蛋白,通过建立过表达MSMEG_6281的耻垢分枝杆菌菌株,推测该蛋白对耻垢分枝杆菌肽聚糖代谢的影响。【方法】利用RT-PCR方法检测乙胺丁醇(Ethambutol,EMB)作用后MSMEG_6281基因的表达变化;以耻垢分枝杆菌基因组DNA为模板,采用PCR技术克隆MSMEG_6281基因,构建分枝杆菌表达质粒p VV16-MSMEG_6281,进一步建立MSMEG_6281过表达的耻垢分枝杆菌菌株;利用生长曲线检测MSMEG_6281过表达对耻垢分枝杆菌生长的影响;利用扫描电子显微镜分析MSMEG_6281过表达引起的耻垢分枝杆菌形态变化。【结果】EMB处理引起MSMEG_6281基因表达上调;构建了过表达MSMGE_6281的耻垢分枝杆菌菌株(mc2155/p VV16-MSMEG_6281);过表达MSMGE_6281的耻垢分枝杆菌生长缓慢,菌体形态由短杆状转变为长杆状。【结论】MSMGE_6281的过表达可改变耻垢分枝杆菌形态。MSMGE_6281的功能与细胞壁肽聚糖水解相关,在mc2155细胞壁形态维持方面发挥重要作用。

定量蛋白质组分析蚯蚓血红蛋白样蛋白MSMEG_3312介导的分枝杆菌耐红霉素机制（英文）

【目的】细菌耐药机制是个复杂的机制,系统生物学是系统性揭示耐药机制的有力研究手段。我们课题组前期研究结果显示,蚯蚓血红蛋白样蛋白msmeg_3312基因敲除后能够增加耻垢分枝杆菌对红霉素的耐药性,本文系统研究MSMEG_3312参与红霉素耐药性形成的机制。【方法】首先纯化MSMEG_3312蛋白,利用光谱及圆二色谱描述MSMEG-3312蛋白。利用定量蛋白质组学的方法比较分析敲除菌株Δmsmeg_3312与野生型菌株mc^2155蛋白表达的差异,并通过qRT-PCR进行验证。利用红霉素ELASA试剂盒测定Δmsmeg_3312与mc^2155的胞内药物浓度。【结果】光谱及圆二色谱分析确定MSMEG_3312是蚯蚓血红蛋白样蛋白。定量蛋白质组学分析发现,红霉素未处理的条件下,相比于野生型菌株mc^2155,敲除菌株Δmsmeg_3312有包括3种转运蛋白在内的8种蛋白表达水平上调,14种蛋白表达下调;而红霉素处理后,Δmsmeg_3312中有448种蛋白差异表达,其中有11种转运蛋白表达上调,26种蛋白与氨基酸合成通路相关。胞内药物浓度检测显示敲除菌株Δmsmeg_3312的胞内红霉素浓度显著低于野生型菌株。【结论】蚯蚓血红蛋白样蛋白MSMEG_3312调控改变了细菌对红霉素药物处理的反应网络,其介导的红霉素耐药是一种集合抗生素耐受机制。

耻垢分枝杆菌的蚯蚓血红蛋白样蛋白MSMEG_3312影响其大环内酯类药物的敏感性

【目的】活性氧类分子是机体有氧代谢的自然产物,可以引起氧化损伤,导致细胞DNA突变、蛋白质失活,是细菌耐药产生的原因之一。蚯蚓血红蛋白家族是能携带氧、可逆地结合氧的一类蛋白,在氧代谢过程中发挥重要作用,与活性氧类分子介导的细菌耐药相关。预测耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis)MSMEG_3312是蚯蚓血红蛋白样蛋白,其功能可能与细菌抗药性有关。【方法】通过生物信息学预测耻垢分枝杆菌MSMEG_3312的结构特征。通过基因敲除、遗传互补和抗药性分析以及启动子表达测定等方法研究MSMEG_3312与耻垢分枝杆菌抗药的相关性。【结果】与野生菌株mc2155相比,msmeg_3312敲除菌株表现为抗大环内酯类抗生素,而且回补msmeg_3312部分丧失了这种耐药表型。此外,大环内酯类抗生素的胁迫在统计上显著下调msmeg_3312启动子的表达。另外,对作用于核糖体的其他药物,敲除菌株和野生菌株没有抗药性差异。【结论】生物信息学分析显示MSMEG_3312的氨基酸序列具有典型的蚯蚓血红蛋白保守的HHE结构域,预测其二级结构含有4个α-螺旋组成的典型蚯蚓血红蛋白结构。MSMEG_3312与耻垢分枝杆菌对大环内酯类抗生素的药物敏感性相关,其可能通过影响药物与核糖体50S亚基的作用来发挥功能。