金属硫蛋白-2(MT-2)表达调控和蛋白相互作用研究进展

金属硫蛋白-2(metallothionein-2,MT-2)作用广泛,具有多种生物学功能。本文介绍了MT-2生物学特性、表达调控机制和蛋白相互作用等研究进展,以期对MT-2蛋白有更全面的认识,并基于某一特定疾病进行系统性研究。

山羊、绵羊MT-IV分子特性研究

金属硫蛋白（MTs）是一类低分子量、金属和半胱氨酸含量高的细胞质蛋白，哺乳动物的MTs包括MT-I、MT-Ⅱ、MT-Ⅲ和MT-Ⅳ4种亚型，其中MT-Ⅳ只在磷状复层扁平上皮细胞中表达，相关研究报道较少。本研究根据GenBank已公布的动物MT-Ⅳ基因序列，设计出扩增山羊和绵羊MT-Ⅳ基因的特异性PCR引物MT-IVSP1和MT-ⅣSP2，利用RT-PCR的方法，分别从山羊和绵羊的瘤胃组织mRNA中，克隆出山羊和绵羊的MT-IV基因编码区序列（均为189bp），序列登录GenBank，获得序列号EF470251和EF624067。通过序列分析，表明山羊和绵羊两个物种MT-Ⅳ基因编码区全编码均为189bp、编码62个氨基酸，其中绵羊的MT-Ⅳ含有20个半胱氨酸，而山羊第6l位保守的半胱氨酸被色氨酸所代替。两个物种的MT-IV均不含芳香族氨基酸，含有MTs特有的C—X—C、C—X—X—C、C—C—X-C．C结构，无明显的跨膜结构域，无信号肽，是一种细胞质蛋白。二级结构分析表明两个物种的MT-Ⅳ二级结构大多数为无规则卷曲结构，分别在第7-9和第49～51氨基酸残基性存在折叠结构，不存在螺旋结构。三级结构预测结果表明两个物种MT-Ⅳ的三级结构由0c和D两个结构域组成，其中β结构域相同，仪结构域山羊少一个半胱氨酸残基，其结构与绵问存在明显差异，这一差异可能对山羊MT-Ⅳ的生理功能产生一定影响，有必要深入研究。

oleosin-MT融合蛋白在拟南芥中的表达及鉴定

【目的】获得转金属硫蛋白(MT)基因的拟南芥植株,为利用植物生物反应器规模化生产MT奠定基础。【方法】利用融合PCR方法,扩增拟南芥MT基因与油体蛋白oleosin基因的融合基因,将融合基因克隆至表达载体pOP上,构建重组质粒pOP-oleosin-MT。采用冻融法将质粒pOP-oleosin-MT转入根癌农杆菌EHA105中,通过农杆菌介导法转化拟南芥,用PCR检测并筛选转基因拟南芥阳性植株,采用SDS-PAGE法检测oleosin-MT融合蛋白的表达,用邻苯三酚自氧化法和结晶紫法测定融合蛋白的体外抗氧化活性。【结果】成功构建了植物油体特异表达载体pOP-oleosin-MT,融合蛋白oleosin-MT在拟南芥种子中成功表达,其分子质量为26ku;总蛋白质量浓度达到50μg/μL时,超氧阴离子的清除率最高,为58.5%;总蛋白质量浓度为10μg/μL时,羟自由基清除率可达69.7%。【结论】成功获得转MT基因的拟南芥株系,并证明融合蛋白oleosin-MT在拟南芥中具有良好的体外抗氧化活性。

大肠癌MTS基因突变和p16蛋白表达

[目的]分析大肠癌MTS基因突变与 p16蛋白表达的关系。[方法]应用PCR -SSCP技术及LSAB免疫组织化学法同时检测135例大肠癌MTS基因的突变和其基因产物(p16蛋白)的表达情况。[结果]135例大肠癌MTS基因的突变率为4.44% ,与正常粘膜组织相比差异并无显著性 ,p16蛋白阳性率为59.25% ,与正常粘膜组织相比有显著性差异(P<0.05)。[结论]大肠癌极少发生MTS基因突变 ,但有较高的 p16蛋白表达下调。MTS基因表达障碍可能有另外原因。

乳腺癌中MTS_1基因外显子2及蛋白表达的初步研究

目的 :初步探测 MTS1 基因外显子 2缺失及其表达的 P16蛋白阴性在乳腺癌发生发展中的作用。方法 :采用多重PCR扩增 MTS1 基因外显子 2 ,免疫组化染色 (SP法 )检测 P16蛋白表达。结果 :本组乳腺癌中 MTS1 基因外显子 2的纯合子缺失频率为 35 .8% (19/ 5 3)。蛋白阴性占 19.4% (7/ 36 )。三种类型的乳腺癌中 MTS1 基因变异及 P16蛋白阴性频率有明显差异 ,淋巴转移组的基因变异及蛋白阴性频率极显著高于未转移组 (P <0 .0 1)。结论 :MTS1 基因外显子 2变异及 P16蛋白阴性与乳腺癌的病理组织分型相关 ,与乳腺癌的恶性进程密切相关。

线粒体未折叠蛋白反应在棕榈酸诱导肾小管上皮细胞脂质聚集中的作用

目的探讨线粒体未折叠蛋白反应(mitochondrial unfolded protein reaction,UPR^(mt))对肾小管上皮细胞(human kidney 2,HK-2)脂代谢的影响。方法采用棕榈酸(palmitic acid,PA)诱导HK-2细胞内脂质聚集,分别予siRNA抑制UPR^(mt)或巴多索隆(the 2-cyano-3,12-dioxooleana-1,9-dien-28-oic acid,CDDO)增强UPR^(mt)。油红染色观察细胞内脂质聚集情况,线粒体膜电位检测试剂盒(JC-1)测定线粒体膜电位(mitochondrial membrane potential,MMP),Mito-SOX测定线粒体内活性氧(reactive oxygen species,ROS)含量,Western blotting检测HSP60、LONP1、CLPP、ACOX1、PPARα、PGC1α、CPT1α蛋白表达。结果PA诱导HK-2细胞脂质聚集、MMP降低、ROS产生增多及UPR^(mt)关键蛋白HSP60、LONP1表达降低;抑制UPR^(mt)可加剧PA导致的脂质聚集、MMP降低、ROS产生增多,HSP60、LONP1表达进一步降低;增强UPR^(mt)可缓解PA导致的脂质聚集、MMP降低、ROS产生增多以及HSP60、LONP1表达降低。结论PA诱导的HK-2细胞脂质聚集可能与线粒体功能障碍有关,UPR^(mt)在该过程中对HK-2细胞具有保护作用。

血浆热休克蛋白70、褪黑素、可溶性细胞黏附因子水平与新生儿窒息的相关性研究

目的 观察血浆热休克蛋白70 (HSP70)、褪黑素(MT)、可溶性细胞黏附因子(sICAM-1)水平与新生儿窒息的相关性。方法 选取2019年3月至2021年3月南阳医学高等专科学校第一附属医院新生儿科收治窒息新生儿为窒息组(74例),另选足月健康新生儿为对照组(67例)。两组新生儿均出生24 h内采取脐动脉血,分离血清检验两组HSP70、MT、sICAM-1水平,比较两组及新生儿窒息不同窒息程度患儿的HSP70、MT、sICAM-1水平,并采用Pearson相关性分析HSP70、MT、sICAM-1与Apgar评分的相关性。结果 窒息组血清中的HSP70、sICAM-1高于对照组,MT低于对照组(P<0.05);74例窒息新生儿中,窒息程度轻度者32例(轻度组),重度者42例(重度组),两组HSP70、sICAM-1水平比较:轻度组<重度组,两组MT水平比较:轻度组>重度组(P<0.05);相关性分析结果显示,HSP70与sICAM-1与窒息程度均呈负相关,MT与窒息程度呈正相关(P<0.05)。结论 血清HSP70、sICAM-1和MT因子与新生儿窒息程度密切相关,能有效反应新生儿窒息的严重程度,可作为检测新生儿窒息的重要指标,值得临床应用。

镉超积累植物及植物镉积累特性转基因改良研究进展

植物提取修复技术是一项既经济又环保的土壤镉(Cd)污染修复技术,该技术的关键是筛选Cd超积累植物或利用基因工程手段改良植物以提高其Cd积累能力。人们已发现遏兰菜等7种Cd超积累植物及美人蕉等潜在的Cd超积累植物。还发现了许多与Cd耐受和积累能力有关的基因:(1)编码与Cd积累、耐受有关酶的基因,如细菌中的ACC(1-aminocyclopropane-1-carboxylic acid),植物中的PCS(Phytochelatin Synthase)基因;(2)编码金属结合蛋白的基因:MT(Metallothionein)、转运蛋白(P-type ATPase、ABC型转运器)基因;(3)其它相关基因:Hvhsp17、PvSR2(Phaseolus vulgaris stress-related gene number 2)等。并将其中的一些基因转入到其它生物中,提高了其对Cd的耐受性和积累量,为实现Cd污染土壤修复的目标奠定基础。

小球藻锌结合类金属硫蛋白的结构表征及抗菌活性

小球藻经60μmol/L的锌胁迫培养5d后,离心收集藻泥,经超声波细胞破碎后,离心得到上清液即蛋白质粗提液,再经葡聚糖凝胶层析柱G-75及脱盐柱G-25分离、纯化后,收集的蛋白组分经真空冷冻干燥后获得小球藻锌结合蛋白。通过Tricine-SDS-PAGE电泳、氨基酸组成及紫外光谱等方法进行表征,测得该蛋白的分子量约为8.2ku,半胱氨酸含量为15.4%,具有金属硫蛋白典型的紫外光谱特征,称为类金属硫蛋白(Zn-MT-like proteins)。试验采用琼脂糖孔穴扩散法,研究了小球藻Zn-MT-like蛋白对3种细菌(大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和枯草芽胞杆菌)和3种真菌(青霉菌、曲霉菌、酵母菌)的抗菌活性,并与兔肝Zn-MTs的抗菌能力进行比较。结果表明,小球藻Zn-MT-like蛋白对革兰氏阳性菌(金黄色葡萄球菌、枯草芽胞杆菌)和霉菌(青霉、曲霉)具有显著的抗菌活性,1mg/mL的Zn-MT-like蛋白对金黄色葡萄球菌、枯草芽胞杆菌、青霉和曲霉的抑菌圈直径分别为13.2、17.4、7.2和9.8mm;而对大肠杆菌、酵母菌则无抗菌活性。同样条件下,未加锌胁迫的小球藻蛋白质本身和兔肝Zn-MTs并不具有这些抗菌能力。小球藻Zn-MT-like蛋白抗菌活性的发现为进一步综合开发利用小球藻提供了实验基础。

锌胁迫对小球藻抗氧化酶和类金属硫蛋白的影响

通过对抗氧化酶活性和类金属硫蛋白的测定,考察在0、5、10、20、50和100μmol/L Zn2+(氯化锌)胁迫下锌对普通海洋小球藻的生物学影响。结果表明:不同浓度Zn2+均能抑制小球藻的生长,当Zn2+浓度大于10μmol/L时,小球藻生物量随培养时间延长而迅速下降;过氧化物歧化酶(SOD)活性随Zn2+胁迫浓度的增加而增加,当Zn2+浓度为50μmol/L时SOD活性达到最大,但继续增加Zn2+胁迫浓度反而导致SOD活性下降;而过氧化物酶(POD)活性则随着Zn2+胁迫浓度的增加而降低。同时,实验发现藻细胞内有两种主要的锌结合形态,其中Zn结合类金属硫蛋白(Zn-MT-like)与兔肝金属硫蛋白(MT)的分子量相近,且随着Zn2+胁迫浓度的增加而出现规律性地增多。因此,藻细胞内Zn-MT-like蛋白的诱导量可作为小球藻受Zn2+胁迫的响应指标。

聚球藻类金属硫蛋白的纯化及部分性质的研究

单细胞蓝藻（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｕｓｓｐ．ＰＣＣ７９４２）以５０μｍｏｌ／ＬＺｎ２＋诱导８ｄ后收集，破碎取上清液经凝胶过滤、离子交换层析及反相ＨＰＬＣ纯化得到类金属硫蛋白，产率为每升培养液收集１．５ｇ鲜藻，得２．５ｍｇ纯品．其单体分子量为８７５０，Ｎ未端测定为缬氨酸，氨基酸组成分析得每分子（５６个氨基酸）含１０个半胱氨酸，疏水氨酸较多，且含有芳香族氨基酸，原子吸收光谱测得每分子蛋白结合４个二价金属．以上表明，该种类金属硫蛋白与哺乳动物金属硫蛋白结构差异很大，可能只是一种进化上的趋同．

MDM2/MDMX双靶点抑制蛋白在p53突变型乳腺癌中的作用及机制

目的:明确MDM2/MDMX双靶点抑制蛋白在p53突变型乳腺癌中的抗肿瘤作用及可能机制。方法:采用MTT比色法检测细胞增殖、流式细胞仪测定细胞周期和Annexin V/FITC-PI双染法检测细胞凋亡,明确MDM2/MDMX抑制蛋白对mt-p53乳腺癌的抗肿瘤活性。应用Western Blot检测MDM2、MDMX、p53、p21、PUMA和bax蛋白在mt-p53乳腺癌细胞中的表达水平,初步探讨抑制蛋白抗mt-p53乳腺癌的可能机制。结果:MDM2/MDMX抑制蛋白抑制mt-p53乳腺癌细胞24 h、48 h细胞增殖显著优于Nutlin-3α(P均<0.05)。MDM2/MDMX抑制蛋白干预mt-p53乳腺癌细胞株24 h和48 h后G 0/G 1期的细胞比例明显高于Nutlin-3α(P<0.05)。抑制蛋白诱导mt-p53乳腺癌细胞24 h和48 h凋亡比例为(15.97±1.48)%和(17.80±2.21)%(MDA-MB-231细胞);(11.09±2.45)%和(10.44±2.90)%(BT-474细胞)。mt-p53乳腺癌细胞中,抑制蛋白干预组MDM2和MDMX蛋白表达明显降低,p53蛋白则未见明显变化;PUMA、p21和bax蛋白表达则显著增加。结论:MDM2/MDMX抑制蛋白可抑制mt-p53乳腺癌细胞增殖,阻滞周期于G0/G1期和诱导细胞凋亡。抑制蛋白可抑制MDM2和MDMX蛋白的表达,但未能激活p53蛋白表达,以p53非依赖途径上调p21,bax和PUMA蛋白表达发挥抗乳腺癌活性。

植物耐重金属分子生理机制研究进展

植物可以通过一系列动态的分子生理机制来减少重金属的胁迫.这些机制包括重金属离子与细胞壁的结合,限制重金属离子透过细胞膜,重金属离子或化合物的排出,重金属在植物体内的转移,重金属的络合与区隔化以及植物对胁迫的基本的反应机制如胁迫蛋白含量的变化等.本文就植物耐重金属的分子生理机制进行综述.

蛤蚧蛋白组分对肝癌HepG-2细胞生长抑制作用的研究

目的从蛤蚧组织液中筛选对肝癌HepG-2细胞具有生长抑制作用的蛋白组分,体外研究其抗肿瘤作用及机制。方法提取蛤蚧蛋白,用sephadexG-50凝胶层析分离出不同分子量的蛤蚧蛋白组分,采用MTS法观察蛤蚧蛋白各组分对肝癌HepG-2细胞的生长抑制作用;Hoechst33342/PI双荧光染色法观察其作用前后的细胞凋亡,并用RT-PCR法检测蛤蚧蛋白组分作用后bax、bcl-2、cmyc和p53基因的表达情况。结果 sephadexG-50凝胶层析可分离出3种分子量不同的蛤蚧蛋白组分,3种蛤蚧蛋白组分都具有不同程度地抑制HepG-2细胞生长的作用,其中分子量为3～20KD的蛤蚧蛋白组分抑制作用最强,且具有剂量依赖性。Hoechst33342/PI双荧光染色法检测显示3～20KD蛤蚧蛋白作用后坏死细胞和凋亡细胞均增加,RT-PCR法检测发现3～20KD蛤蚧蛋白组分作用后c-myc基因mRNA表达水平稍降低,p53基因mRNA表达水平升高,但两者差异均无统计学意义,bax基因mRNA表达水平明显增高,差异有统计学意义,bcl-2基因在蛋白作用前后均无表达。结论实验提取的蛤蚧蛋白对肝癌HepG-2细胞具有生长抑制作用,分子量3～2KD的蛤蚧蛋白组分抑制作用最强。其作用机制可能为蛤蚧蛋白通过调高肿瘤bax基因mRNA表达水平诱导肝癌HepG-2细胞凋亡。

子午流注结合常规针刺法对胃黏膜损伤家兔褪黑素及HSP70的影响

目的:观察子午流注针法配合常规针刺对急性胃黏膜损伤家兔胃黏膜的修复作用,为临床治疗本病提供部分实验依据。方法:将40只雌雄各半的家兔随机分为5组,每组8只:空白组(A组)、模型组(B组)、常规针刺组(C组)、子午流注戌时取穴结合常规针刺组(D组)、子午流注辰时取穴结合常规针刺组(E组)。采用无水乙醇造模法将家兔造成急性胃黏膜损伤模型,治疗7 d后剖腹取胃观察胃黏膜损伤指数(UI),检测胃黏膜组织中MT、HSP70含量的变化。结果:模型组UI值明显高于空白组(P<0.01);与模型组比较,常规针刺组、戌时组、辰时组的UI值均有明显降低(P<0.01);辰时组UI值低于常规针刺组、戌时组(P<0.05);空白组的MT、HSP70含量均低于其它各组(P<0.01);与模型组比较,常规针刺组、戌时组、辰时组的MT、HSP70含量均明显增高((P<0.01);辰时组与常规针刺组、戌时组比较,MT、HSP70均含量增高(P<0.05)。结论:子午流注结合常规针刺针法能降低急性胃黏膜损伤家兔胃黏膜损伤指数(UI),对胃黏膜损伤后的修复起到积极的促进作用;子午流注结合常规针刺针法能促进胃黏膜MT、HSP70的合成与分泌,说明该治疗方法对胃黏膜的修复作用可能与MT,HSP70的作用机制有内在联系。

全胸腔镜肺叶切除对老年肺癌患者蛋白代谢反应指标及应激因子的影响

【目的】探讨全胸腔镜肺叶切除对老年肺癌患者蛋白代谢反应指标及应激因子的影响。【方法】回顾性选择2016年4月至2018年4月在本院诊治的120例肺癌患者,根据手术方案不同分为观察组和对照组。观察组采用全胸腔镜肺叶切除术,对照组采用传统开胸肺叶切除术。比较两组手术情况及手术前、术后5 d血清蛋白代谢反应指标视黄醇结合蛋白(RBP)、前清蛋白(PA)、转铁蛋白(TRF)和疼痛应激因子缓激肽(BK)、P物质(SP)、前列腺素E2(PGE2)水平。【结果】观察组切口长度、出血量、手术时间、住院时间均明显少于对照组,其差异有统计学意义(P<0.05)。术后,观察组血清RBP、PA、TRF水平降低幅度小于对照组,血清BK、SP、PGE2水平上升幅度小于对照组,其差异均有统计学意义(P<0.05)。【结论】采用全胸腔镜肺叶切除术治疗老年肺癌患者,可降低患者的疼痛应激程度,对代谢反应的影响相对较小,是一种安全有效的治疗方法,值得临床推广应用。

拟南芥MAP65-6活体探针的构建

植物细胞中有许多重要的成束的微管结构,如周质微管、细胞质丝束、早前期带、纺锤体微管和成膜体微管等.生化研究已经证实微管相关蛋白MAP65家族的成员具有交联微管使之成束的能力.本文构建了GFP-融合蛋白植物表达载体(pMAP65-6-GFP),并将其转入拟南芥,研究MAP65-6的定位与功能.获得了MAP65-6 C-末端与GFP融合表达的拟南芥转基因株系.运用荧光显微镜初步研究了转基因株系植株和细胞的GFP荧光信号.结果显示,MAP65-6主要呈现细胞质定位,获得的活体探针可以用于MAP65-6和微管功能的进一步研究.

妊娠区带蛋白(PZP)的分离、纯化及其鉴定

本文采用人胎盘后血为原料,经Sephadex G 200,DEAE-Sephadex A-50层析,等电聚焦电泳,Sepharose 4B负亲和层析技术,从胎盘后血清中分离、纯化出PZP纯品,经8.0％聚丙烯酰胺凝胶圆盘电泳,免疫电泳和双向免疫交叉试验,证实其为单一的成份。

褪黑素对内毒素致大鼠急性肺损伤的保护作用

目的:研究内毒素(LPS)致大鼠急性肺损伤(ALI)时,p-p38蛋白激酶(p-p38MAPK)在肺组织的表达及褪黑素(MT)对肺组织的保护作用及其机制。方法:将72只健康雄性SD大鼠随机分为3组,每组24只,对照组(Control)、模型组(LPS)和褪黑素干预组(LPS+MT),采用气管内滴注LPS的方法建立大鼠ALI的模型,通过免疫组织化学染色和Western blot技术检测大鼠肺组织中p-p38蛋白激酶的表达变化,并在光镜下观察大鼠肺组织形态学变化。结果:Control组气道和肺组织可见反应极弱的p-p38蛋白激酶阳性细胞,散在分布于气道上皮细胞和肺泡上皮细胞;LPS组p-p38蛋白激酶阳性细胞较对照组明显增多(P<0.05或P<0.01),主要分布于浸润的炎症细胞、气道上皮细胞、肺泡上皮细胞和血管内皮细胞;LPS+MT组气道和肺组织中阳性细胞数较LPS组明显减少(P<0.05或P<0.01),Western blot结果与免疫组织化学一致。结论:LPS致大鼠急性肺损伤模型中,肺内炎性、非炎性细胞均有p38MAPK信号通路的激活;MT对急性肺损伤的保护机制可能与其抑制p38 MAPK信号通路的过度激活有关。

金属硫蛋白基因转化黄瓜的研究

以黄瓜无菌苗子叶切段为外植体,通过叶盘转化法与根瘤农杆菌进行共培养建立了黄瓜的遗传转化体系。比较了不同苗龄,不同侵染时间对黄瓜离体再生的影响,并做了潮霉素敏感性测试。结果表明：苗龄3-4 d的子叶,侵染时间为15 min,潮霉素浓度为25 mg/L最适分化出抗性小苗。最终获得3株抗性植株,经过PCR和RT-PCR检测,初步确定均为阳性转化植株。