小鼠胚胎干细胞中MT-Ⅱ基因的定位改变

构建了小鼠MT－Ⅱ基因的定位整合载体pMT－Ⅱ6.7，这是一个置换型载体，它包含了6．7kb的与MT－Ⅱ基因及其旁侧序列同源的序列。用电穿孔方法将这一载体转化入小鼠ES细胞Mespu22中，在G418R、GancR的双抗性克隆中，用PCR方法进行筛选，从104个克隆中获得26个阳性克隆；对这26个克隆进行核型分析表明，其中有2个克隆，即克隆5－2和8-4的核型（2n=40，XY）正常率很高，达到84％和88％；进一步用Southern杂交分析，结果证明，在MT－Ⅱ基因位点确实发生了定位整合事件。利用这两个克隆的细胞进行体内、体外分化实验表明，它们具有体内、体外分化能力，进一步进行了嵌合体的制作，现已获得用克隆8-4细胞制作的嵌合体小鼠。

克隆含有MT-Ⅰ和MT-Ⅱ基因的染色体DNA片段及其内切酶图谱的鉴定

用小鼠ＭＴ－ⅠｃＤＮＡ作为探针，从１２９小鼠的基因组库中获得含ＭＴ－Ⅰ基因的ＤＮＡ片段。从６．８×１０５的噬菌斑中挑出４个阳性噬菌体克隆，分别命名为１－１，２－１，１－６和４－３。在这４个克隆中１－１和２－１的阳性信号更强些。应用插入片段的末端引物作为探针进行杂交结合部分酶切的方法，对这２个克隆的插入片段进行了限制性内切酶酶切图谱分析，确定了克隆１－１和２－１的酶切图谱及ＭＴ－Ⅰ基因在２个克隆ＤＮＡ中的位置。并进一步发现和证明了在２个克隆中含有ＭＴ－Ⅱ基因。