【目的】建立基于多重串联式PCR(multiplexed tandem PCR,MT-PCR)的基因碟片技术,并使之应用于转基因作物的大量、快速和稳定地检测。【方法】以转基因作物研究中常用的调控序列NOS终止子、FMV35S启动子及外源基因NPTⅡ、Cry1Ab、Cry1Ab...【目的】建立基于多重串联式PCR(multiplexed tandem PCR,MT-PCR)的基因碟片技术,并使之应用于转基因作物的大量、快速和稳定地检测。【方法】以转基因作物研究中常用的调控序列NOS终止子、FMV35S启动子及外源基因NPTⅡ、Cry1Ab、Cry1Ab/Ac、CP4-EPSPS、PAT和玉米内源基因IVR、棉花内源基因sad1、菜籽粕内源基因PEP为检测对象,针对每个基因设计内外2对引物,先进行一次循环数较少(10—20 cycles)的高通量多重PCR,以便在均匀地扩增各基因和调控序列的同时避免引物之间的竞争,然后利用巢式荧光定量PCR检测各个基因和调控序列,最后根据扩增曲线和熔融曲线分析结果。【结果】该方法能够快速(<2 h)、高通量、准确地(>0.000292 ng)检测出棉花、玉米、大米、菜籽粕中的多种转基因成分,可以分辨出3种转基因物种,适合大批量检测。【结论】该方法适合转基因作物的高通量、定量检测,具有较好的应用前景。展开更多
【目的】快速鉴定我国进境植物检疫性害虫南瓜实蝇Bactrocera tau(Walker),防止该虫传入扩散。【方法】基于物种特异性PCR(SS-PCR)技术,选取20种形态近似的常见实蝇,将南瓜实蝇作为阳性对照,提取基因组DNA模板,选用mt DNA COⅠ序列,检...【目的】快速鉴定我国进境植物检疫性害虫南瓜实蝇Bactrocera tau(Walker),防止该虫传入扩散。【方法】基于物种特异性PCR(SS-PCR)技术,选取20种形态近似的常见实蝇,将南瓜实蝇作为阳性对照,提取基因组DNA模板,选用mt DNA COⅠ序列,检查同源系列,设计筛选1对可快速准确鉴定南瓜实蝇的种特异性引物NF404和NR610,并进行PCR检测和验证,建立一种利用种特异性引物的快速鉴定方法。【结果】南瓜实蝇在207 bp的位置扩增出一条清晰且单一的目标条带,其余果实蝇未见条带。将截获的南瓜实蝇与其同亚属的近缘种具条实蝇、瓜实蝇的不同虫态和成虫部分虫体组织的虫样,采用本实验室建立的SS-PCR鉴定方法进行验证,结果一致。【结论】建立的南瓜实蝇的SS-PCR鉴定方法种特异性和稳定性强,能快速鉴定目标种类,解决口岸进境果蔬中截获实蝇幼虫、蛹等不同虫态和残体难于快速鉴定问题。展开更多
运用RT-PCR和RACE(rapid amplification of cDNA ends,RACE)技术获得天祝白牦牛金属硫蛋白(MT-2)基因全长cDNA序列,对其生物学进行分析,并通过荧光定量PCR双标准曲线法和2-ΔΔct法建立检测MT-2基因表达的方法.结果表明:扩增获得的天祝...运用RT-PCR和RACE(rapid amplification of cDNA ends,RACE)技术获得天祝白牦牛金属硫蛋白(MT-2)基因全长cDNA序列,对其生物学进行分析,并通过荧光定量PCR双标准曲线法和2-ΔΔct法建立检测MT-2基因表达的方法.结果表明:扩增获得的天祝白牦牛MT-2基因全长为410bp(GenBank登录号:KF888633),ORF长185bp,编码61个氨基酸.该基因无跨膜结构,为非分泌型蛋白.构建系统进化树结果显示,天祝白牦牛MT-2基因在不同物种以及进化的过程中具有高度保守性,与黄牛和羊的亲缘关系最近.荧光定量PCR结果表明,双标准曲线法特异性强、灵敏度高、稳定性好,对天祝白牦牛MT-2的定量检测具有重要意义.展开更多
大肠埃希氏菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、溶藻弧菌、副溶血弧菌、铜绿假单胞菌、产气荚膜梭菌、单增李斯特菌和创伤弧菌是贝类食品中常见的食源性致病菌。该文通过设计特异性引物,优化反应参数以建立多重实时荧光串联PCR(multiplexed ...大肠埃希氏菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、溶藻弧菌、副溶血弧菌、铜绿假单胞菌、产气荚膜梭菌、单增李斯特菌和创伤弧菌是贝类食品中常见的食源性致病菌。该文通过设计特异性引物,优化反应参数以建立多重实时荧光串联PCR(multiplexed tandem PCR,MT-PCR)方法,进一步评估方法的特异性和灵敏度,并用于检测生蚝样品。优化后的MT-PCR方法与常规qPCR具有相同定量能力,可同时检测上述9种致病菌。在对混合菌液的检测中,MT-PCR方法的检测灵敏度最低可达10~2 CFU/mL,且此法对其中6种致病菌的检测灵敏度高于qPCR。应用该技术检测人工染菌的生蚝样品,检测灵敏度为10~2~10~3CFU/g。该研究建立的MT-PCR方法可实现高通量、快速准确地检测生蚝中这9种常见的食源性致病菌,对保障食品安全和评估食源性致病菌污染风险具有重要意义。展开更多
文摘【目的】快速鉴定我国进境植物检疫性害虫南瓜实蝇Bactrocera tau(Walker),防止该虫传入扩散。【方法】基于物种特异性PCR(SS-PCR)技术,选取20种形态近似的常见实蝇,将南瓜实蝇作为阳性对照,提取基因组DNA模板,选用mt DNA COⅠ序列,检查同源系列,设计筛选1对可快速准确鉴定南瓜实蝇的种特异性引物NF404和NR610,并进行PCR检测和验证,建立一种利用种特异性引物的快速鉴定方法。【结果】南瓜实蝇在207 bp的位置扩增出一条清晰且单一的目标条带,其余果实蝇未见条带。将截获的南瓜实蝇与其同亚属的近缘种具条实蝇、瓜实蝇的不同虫态和成虫部分虫体组织的虫样,采用本实验室建立的SS-PCR鉴定方法进行验证,结果一致。【结论】建立的南瓜实蝇的SS-PCR鉴定方法种特异性和稳定性强,能快速鉴定目标种类,解决口岸进境果蔬中截获实蝇幼虫、蛹等不同虫态和残体难于快速鉴定问题。
文摘运用RT-PCR和RACE(rapid amplification of cDNA ends,RACE)技术获得天祝白牦牛金属硫蛋白(MT-2)基因全长cDNA序列,对其生物学进行分析,并通过荧光定量PCR双标准曲线法和2-ΔΔct法建立检测MT-2基因表达的方法.结果表明:扩增获得的天祝白牦牛MT-2基因全长为410bp(GenBank登录号:KF888633),ORF长185bp,编码61个氨基酸.该基因无跨膜结构,为非分泌型蛋白.构建系统进化树结果显示,天祝白牦牛MT-2基因在不同物种以及进化的过程中具有高度保守性,与黄牛和羊的亲缘关系最近.荧光定量PCR结果表明,双标准曲线法特异性强、灵敏度高、稳定性好,对天祝白牦牛MT-2的定量检测具有重要意义.
文摘大肠埃希氏菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、溶藻弧菌、副溶血弧菌、铜绿假单胞菌、产气荚膜梭菌、单增李斯特菌和创伤弧菌是贝类食品中常见的食源性致病菌。该文通过设计特异性引物,优化反应参数以建立多重实时荧光串联PCR(multiplexed tandem PCR,MT-PCR)方法,进一步评估方法的特异性和灵敏度,并用于检测生蚝样品。优化后的MT-PCR方法与常规qPCR具有相同定量能力,可同时检测上述9种致病菌。在对混合菌液的检测中,MT-PCR方法的检测灵敏度最低可达10~2 CFU/mL,且此法对其中6种致病菌的检测灵敏度高于qPCR。应用该技术检测人工染菌的生蚝样品,检测灵敏度为10~2~10~3CFU/g。该研究建立的MT-PCR方法可实现高通量、快速准确地检测生蚝中这9种常见的食源性致病菌,对保障食品安全和评估食源性致病菌污染风险具有重要意义。
