特定序列寡核苷酸MT01对牙龈卟啉单胞菌感染的成骨细胞的增殖、细胞周期及凋亡的影响

目的通过观察MT01对感染状态下成骨细胞细胞增殖、细胞周期及凋亡的影响,探讨MT01对牙周致病菌感染的成骨细胞生物学性能的影响。方法以人成骨细胞MG63为目的细胞,分别与PBS、MT01、Cp G ODN、甲硝唑和庆大霉素共培养3 h后,按感染复数100∶1的比例加入牙周致病菌牙龈卟啉单胞菌共培养,检测培养24 h和48 h后MG63细胞的增殖、细胞周期及凋亡,以PBS作为空白对照,以牙龈卟啉单胞菌和PBS共培养作为阴性对照。结果 MT01+牙龈卟啉单胞菌组细胞增殖高于空白对照组(P<0.05),G1期细胞百分比低于阴性对照组,而S期细胞百分比高于阴性对照组(P<0.05),细胞早期凋亡率低于阴性对照组(P<0.05)。结论 MT01可促进感染状态下成骨细胞的细胞增殖,降低G1期细胞百分比,促使细胞进入S期并抑制细胞早期凋亡。

MT01对Pg感染的成骨细胞MG63特异性成骨相关因子表达的影响

目的:通过检测MT01对牙周致病菌Pg感染的成骨细胞MG63细胞内特异性成骨相关因子基因表达水平,探讨MT01对感染状态下成骨细胞成骨分化作用的影响。方法:选取生长状态稳定的人成骨样细胞MG63接种于6孔板,分别加入质量浓度1mg/L的特定序列寡核苷酸MT01和等体积PBS,共孵育3h后,加入感染复数MOI=100∶1的Pg菌悬液(对照组加等体积PBS)。即实验分为:MT01+Pg、MT01、Pg和空白对照4组,Realtime PCR检测2、4、6、8、12、24h特异性成骨相关因子Runx2,SP7mRNA的表达。结果:在有无Pg感染的状态下,MT01均可上调成骨细胞MG63细胞内成骨相关因子Runx2,SP7mRNA的表达,但在不同时间点,MT01调控Runx2,SP7mRNA表达上调的能力存在差异。结论:MT01可以促进牙周致病菌感染下的成骨细胞的成骨向分化。

MT01对牙龈卟啉单胞菌感染成骨细胞MG63中Ⅰ型胶原mRNA表达的促进作用及其意义

目的:检测单链寡脱氧核苷酸MT01作用下牙龈卟啉单胞菌(Pg)感染成骨细胞MG63中Ⅰ型胶原(ColⅠ)mRNA表达水平,探讨MT01对感染状态下成骨细胞成骨向分化的影响。方法:体外培养的MG63细胞分为空白对照组、MT01组、Pg组和MT01+Pg组。按分组情况进行相应处理,加入MT01(质量浓度1mg·L-1),以1mg·L-1PBS作对照共孵育3h后,以100∶1的感染复数(MOI)加入Pg悬液共培养。4组细胞分别孵育2、4、6、8、12和24h后采用RT-PCR法检测MG63细胞中ColⅠmRNA表达水平。结果:与空白对照组比较,MT01和MT01+Pg组MG63细胞中ColⅠmRNA表达水平在2和4h时无明显变化(P>0.05),8、12和24h时MT01组细胞中ColⅠmRNA表达水平明显升高(P<0.05或P<0.01);与Pg组比较,2和4h时MT01+Pg组细胞中ColⅠmRNA呈低表达,6、8、12和24h时ColⅠmRNA表达水平升高(P<0.05或P<0.01)。结论:MT01上调感染状态下MG63细胞中ColⅠmRNA的表达水平,MT01可促进感染状态下成骨细胞成骨向分化。

MT01抑制Pg感染小鼠单核/巨噬细胞内NLRP3 mRNA的表达

目的探讨MT01对牙龈卟啉单胞菌(Pg)感染小鼠单核/巨噬细胞NLRP3 mRNA表达的影响。方法选取小鼠单核/巨噬细胞RAW264.7为目的细胞,分别与Pg、MT01、Pg+MT01、磷酸盐缓冲液(PBS)共培养6 h,Real-time PCR检测NLRP3 mRNA的表达。结果与PBS组比较,NLRP3 mRNA的表达在MT01组最低(P<0.05),Pg组最高(P<0.01),Pg+MT01组高于PBS组,但低于Pg组(P<0.01)。结论 MT01可抑制Pg感染所导致的NLRP3 mRNA的表达。

MT01对感染状态人成骨样细胞内ALP活性及mRNA表达的影响

目的:通过检测MT01对牙龈卟啉单胞菌感染的人成骨样细胞内特异性成骨相关因子ALP活性及mRNA表达水平的改变,探讨MT01对感染状态下人成骨样细胞成骨向分化的影响。方法:选取状态良好的MG63细胞接种于6孔板内,2个MT01组加入质量浓度为1mg/L的MT01,共孵育3h后,相应组加入感染复数为100∶1的Pg菌悬液。实验分为:空白对照、MT01、Pg和MT01+Pg4组,碱性磷酸酶测试盒测定24h后上清液及细胞内ALP活性。Real-time PCR检测2、4、6、8、12、24h特异性成骨相关因子ALP mRNA的表达。结果:在感染与非感染情况下,MT01均可促进ALP活性,且上调MG63细胞内成骨相关因子ALP mRNA表达,其表达上调呈时间依赖性。结论:MT01可促进感染及非感染状态下MG63内ALP基因表达水平,提高ALP活力。

Cy5标记寡脱氧核苷酸MT01经大鼠牙龈黏膜局部注射后在重要脏器组织中的分布

目的:观察不同时间点Cy5标记寡脱氧核苷酸(ODN)MT01在大鼠体内重要脏器组织中的分布,初步探讨其分布的规律性。方法:选取60只Wistar大鼠随机分为实验组和对照组,每组30只;实验组大鼠牙龈黏膜局部注射Cy5标记的MT01,对照组大鼠牙龈黏膜局部注射未经标记的MT01;于注射后15min、1h、4h、8h、16h、1d、2d、3d、4d和5d分别取大鼠肺、肝、脾、肾、心和脑组织;激光共聚焦显微镜下观测大鼠重要脏器组织中MT01的荧光分布,以荧光阳性细胞率表示各脏器组织内MT01进入各组织细胞量。结果:对照组大鼠重要脏器组织中未观察到荧光阳性细胞;实验组大鼠除心、脑组织外,肺、肝、脾和肾组织细胞中均可观察到荧光阳性细胞;肾组织中荧光阳性细胞呈片状分布,荧光主要集中于肾小管上皮细胞的胞质中;肝、脾和肾组织的荧光阳性细胞率呈规律性变化,峰值分别出现在注射后4、3和4d时,肺组织的荧光阳性细胞率未见明显规律性。结论:MT01经大鼠牙龈局部注射后可进入肺、肝、脾和肾组织,主要集中在肾脏组织中,且分布具有一定规律性。

氯喹对MT01促进大鼠骨髓间充质干细胞增殖作用的影响

目的:通过检测氯喹(chloroquine,CQ)对MT01促进Wistar大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)增殖的影响,证实MT01可能经由内吞小体对BMSCs细胞生物学性能产生影响。方法:不同工作浓度的CQ与第3代Wistar大鼠BMSCs共培养24、48、72、96h,检测CQ对BMSCs增殖影响的量效和时效关系;在此基础上,加入工作浓度为1mg/L的MT01,MTT法检测不同浓度、不同时间点CQ对MT01作用下BMSCs增殖的影响。结果:适当浓度CQ(4mg/L)具有促进BMSCs增殖的作用;48hCQ刺激BMSCs增殖最明显;低浓度CQ(1mg/L、2mg/L)对MT01促进BMSCs增殖具有抑制作用。结论:CQ对MT01促进BMSCs增殖具有抑制作用,提示MT01可能通过进入BMSCs内吞小体中发挥作用。

MT01对人成骨样细胞系MG63内Toll样受体7,9表达的影响

目的探讨人成骨样细胞系MG63（简称MG63）内Toll样受体（TLRs）的表达情况及MT01与细胞内TLRs的关联。方法应用RTPCR法检测MG63内TLR1~10 mRNA的表达情况;MT01与MG63作用12、24、48 h后,Real time PCR法检测MG63细胞内TLR7,9 mRNA表达的变化;Western印迹法检测MG63细胞内TLR7,9蛋白表达的变化。结果 MG63细胞表达TLR1~10 mRNA;一定浓度的MT01作用于细胞后,对TLR7,9 mRNA及蛋白表达有显著的抑制作用,这种抑制作用无时间依赖性。结论 MG63细胞表达TLR1-10 mRNA,一定浓度的MT01可影响MG63细胞内TLR7,9 mRNA及蛋白的表达。

MT01对实验性牙移动大鼠牙周组织中TLR9、TRAF6和IL-6表达水平的影响

目的:探讨Toll样受体9(TLR9)及其下游炎症因子白细胞介素6(IL-6)在实验性大鼠牙移动过程中牙周组织中表达水平的变化,以及MT01对牙周组织TLR9、肿瘤坏死因子受体相关因子6(TRAF6)和IL-6表达水平的影响,阐明其相关机制。方法:30只雄性Wistar大鼠分为无MT01干预组(n=24)和MT01干预组(n=6)。其中,无MT01干预大鼠右侧加力为实验组,左侧不加力为对照组;MT01干预大鼠左侧上颌第一磨牙颊侧黏膜注射MT01+加力为实验组,右侧上颌第一磨牙颊侧黏膜注射PBS+加力作为对照组。0.49N力近中移动大鼠上颌第一磨牙,无MT01干预大鼠于加力后第3、7、14和21天处死,MT01干预组于加力后第7天处死。分别获取各组大鼠上颌第一磨牙近远中侧牙槽骨,采用实时荧光定量PCR(RT-PCR)法检测张力侧和压力侧牙周组织中TLR9、TRAF6和IL-6mRNA的表达水平。结果:无MT01干预大鼠中,实验组张力侧和压力侧牙周组织中IL-6和TLR9表达水平均明显高于对照组(P<0.05),且加力7d后两者表达水平达高峰;MT01干预大鼠中,加力7d后实验组张力侧及压力侧牙周组织中TLR9表达水平较对照组降低(P<0.01),实验组压力侧牙周组织中TRAF6表达水平较对照组降低(P<0.01)。结论:MT01能够抑制实验性牙移动大鼠牙周组织中TLR9及下游相关因子TRAF6的表达,进而产生抑制牙移动过程中牙周组织炎症反应的作用。

PEN载ODN MT01复合物性能检测及其对成骨细胞增殖的影响

目的：检测PEI衍生物PEN装载ODN MT01复合物性能及PEN/ODN MT01复合物转染MG63细胞对细胞增殖影响。方法：以PEN为载体静电装载ODN MT01,Nanodrop测定PEN与ODN MT01不同质量比时装载效率;琼脂糖凝胶电泳检测PEN装载ODN MT01能力;马尔文粒度电位仪检测PEN/ODN MT01复合物粒度及电位;PEN装载ODN MT01-Cy5转染MG63细胞,观察荧光强度及进行FCM检测;MTT检测转染PEN/ODN MT01复合物细胞增殖率。结果：PEN/ODN MT01复合物随质量比增加表面由负电转为正电,粒径大小90-110nm;ODN MT01与PEN质量比为1∶6时,装载率高达77.67%,且转染MG63细胞荧光强度最大;PEN/ODN MT01复合物与对照组相比明显促进MG63细胞增殖。结论：PEN与ODN MT01质量比为1∶6时,可以高效装载ODN MT01,且可以明显促进MG63细胞增殖。

MT01/PEN复合物对人成骨样细胞MG63表达骨保护蛋白和核因子κB受体活化因子配体的影响

目的应用聚乙烯亚胺阳离子聚合物(PEN)载体装载寡脱氧核苷酸MT01,制备MT01/PEN复合物,检测该复合物对人成骨样细胞MG63表达骨保护蛋白(OPG)和核因子κB受体活化因子配体(RANKL)的影响。方法制备3种不同配比的MT01/PEN(质量比分别为1∶2、1∶4、1∶6)复合物,以全硫代化修饰MT01(MT01-s)和未修饰的MT01作阳性对照,分别转染MG63细胞。采用酶联免疫吸附测定法和real-time聚合酶链反应法分别检测培养24、48、72 h时各组上清液及细胞内OPG和RANKL的表达水平。结果经MT01/PEN复合物转染后,上清液及细胞内OPG表达水平均升高(P<0.05);多数组中RANKL表达水平降低,而OPG/RANKL比值呈升高趋势(P<0.05);不同质量配比的MT01/PEN均对MG63细胞的成骨具有影响,其中质量比为1∶6时作用最明显。结论应用PEN作为基因载体装载MT01可增强MT01对MG63细胞的促成骨作用。

聚乙烯亚胺衍生物PEN介导寡核苷酸MT01递送对实验性大鼠牙移动的抑制作用

目的:探讨聚乙烯亚胺(PEI)衍生物PEN介导寡核苷酸MT01的体内局部递送能力,初步阐明其对实验性牙移动模型大鼠牙槽骨改建的影响及生物学安全性。方法: 48只Wistar雄性大鼠随机均分为PEN组、MT01组、硫代修饰的MT01(MT01s)组和PEN/MT01组,建立实验性牙移动模型,各组大鼠分别于左侧上颌第一磨牙颊侧牙龈黏膜局部注射以上4种药物作为药物干预侧,右侧上颌第一磨牙颊侧牙龈黏膜局部注射PBS作为PBS对照侧,每3 d注射1次,14 d时处死大鼠。HE染色观察大鼠重要脏器组织病理形态表现,大体照片及X线片测量牙移动距离,实时定量荧光PCR(RT-PCR)法检测牙周组织中成骨标志性基因Runt相关转录因子2(Runx2)、成骨细胞特异性转录因子(SP7)和骨钙素(OCN)mRNA表达水平。结果:局部注射以上药物后,各组大鼠的主要脏器组织中均未见明显的炎细胞浸润及结构差异,各脏器组织未见明显异常。与PBS对照侧比较,MT01、MT01s和PEN/MT01组大鼠药物干预侧第一磨牙移动距离均缩小(P<0.05或 P<0.01),PEN组差异无统计学意义(P>0.05),各组大鼠双侧牙齿近中移动距离的差值PEN/MT01组>MT01s组>MT01组>PEN组,且PEN/MT01组与MT01s组比较差异有统计学意义(P<0.05)。与PBS对照侧比较,MT01s组和PEN/MT01组大鼠药物干预侧牙周组织中Runx2、SP7和OCN mRNA表达水平均明显升高(P<0.05或 P<0.01),且PEN/MT01组升高最为明显;MT01组大鼠药物干预侧牙周组织中Runx2 mRNA表达水平降低(P<0.05),SP7和OCN mRNA表达水平明显升高(P<0.01);PEN组大鼠药物干预侧牙周组织中Runx2 mRNA表达水平降低(P<0.05),SP7和OCN mRNA表达水平差异无统计学意义(P>0.05)。结论: PEI衍生物PEN可安全递送MT01进入体内,使牙周组织中Runx2、SP7和OCN mRNA表达水平升高,减少实验性牙移动大鼠的牙齿移动距离。

mt01对人牙周膜细胞中成骨细胞相关因子mRNA表达的影响

临床上很多牙病治疗需要借助牙齿的再生功能才能达到治疗的目的,如口腔正畸,通过外力将牙齿移动位置后原有的牙齿发生了位移,其原有的牙骨受到破坏,需要在新位置上的牙周膜细胞重新生成牙骨,通过这种破骨-成骨过程达到实现骨改建的目的（[1,2]）。在此过程中,牙周膜细胞中成骨分化是实现牙槽骨改建最重要的步骤（[3,4]）。

寡核苷酸MT01及其在牙周炎方向的研究进展

MT01是依据人线粒体DNA序列设计的单链寡核苷酸,具有免疫负调节活性。多项研究显示,MT01在抑制由病原体感染所引起的有害、过度的免疫反应以及抑制牙槽骨吸收和促进成骨细胞活化方面有着显著的效果。炎症和骨吸收是牙周疾病的本质。本文就MT01的最新研究进展及其在牙周炎方向的相关研究做一综述。

牙周炎患者自身组织核酸刺激小鼠巨噬细胞后对破骨相关因子mRNA表达的影响

目的检测牙周炎患者自身组织核酸刺激巨噬细胞后破骨相关因子白细胞介素-6(IL-6)、白细胞介素-12(IL-12)p35、IL-12p40、基质金属蛋白酶-9(MMP-9)、活化T细胞核因子1(NFATc1)、核激活因子κB受体(RANK)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)mRNA的表达,观察牙周炎患者自身组织核酸对巨噬细胞向破骨细胞分化的影响作用。方法采集翻瓣术中慢性牙周炎患者炎症牙周组织及正畸患者健康牙拔除术获取的健康牙周组织,提取组织总RNA逆转录cDNA。培养小鼠巨噬细胞系RAW264.7,加入质量浓度1μg·mL-1的特定序列寡核苷酸MT01共孵育3 h后(以1μg·mL-1的PBS作为对照),加入已提取的炎症牙周组织及健康牙周组织cDNA(质量浓度为1μg·mL-1)。实验分4组:健康组织cDNA,炎症组织cDNA,MT01+健康组织cDNA,MT01+炎症组织cDNA。4组细胞分别孵育3、6、12、24 h,采用实时定量聚合酶链反应法检测破骨相关因子IL-6、IL-12p35、IL-12p40、MMP-9、NFATc1、RANK及TNF-αmRNA的表达,进行两两组间比较。结果牙周炎患者自身组织核酸可上调RAW264.7破骨相关因子IL-6、IL-12p35、IL-12p40、MMP-9、NFATc1、RANK及TNF-αmRNA的表达;在免疫抑制剂MT01的作用下,牙周炎患者自身组织核酸上调RAW264.7内破骨相关因子mRNA的表达状况受到抑制。结论牙周炎患者自身组织核酸可以影响小鼠巨噬细胞向破骨细胞的分化。

PEN载体传递ODN对人成骨样细胞细胞周期与成骨分化的影响

目的:采用新型载体PEN对ODN进行传递,探讨MT01/PEN复合物对人成骨样细胞(MG63)细胞周期及成骨分化的影响。方法:选取不同装载比例的MT01/PEN复合物,以MT01及S-MT01做对照,分别检测其对MG63细胞周期及成骨分化相关基因ALP活性、BMP2、OCN表达的影响。结果:MT01/PEN组Gl期、G2期细胞百分比降低,S期比例增高(P<0.01),碱性磷酸酶活性增加(P<0.01),OCN、BMP2蛋白表达增高(P<0.05)。结论:以PEN为载体传递MT01能促进MG63的分化。