两个品种山羊MTNR1A基因组织表达差异研究

大部分山羊表现出季节性发情繁殖特点,但其分子遗传机理尚不清楚。近年来,越来越多的研究结果提示,哺乳动物的季节性繁殖与MTNR1A基因有关。为探明山羊MTNR1A基因的作用,采用荧光定量PCR(qRT-PCR)方法对常年发情的济宁青山羊和季节性发情的辽宁绒山羊下丘脑-垂体-卵巢繁殖轴组织中MTNR1A基因mRNA的表达差异进行了对比分析。组织表达谱结果发现,MTNR1A m RNA在两品种山羊的下丘脑、大脑皮层、海马体、卵巢和辽宁绒山羊垂体中均有表达。荧光定量PCR结果分析发现,MTNR1A基因在两品种山羊下丘脑中的表达量较高(P<0.05),在卵巢中有一定的表达,而在垂体中的表达量较低;在辽宁绒山羊下丘脑和卵巢中MTNR1A基因的表达量高于济宁青山羊(P>0.05)。提示MTNR1A基因可能与山羊季节性繁殖调控有关,值得进一步深入研究。

策勒黑羊BMPR-IB、MTNR1A和PTGS2基因的RFLP分析

【目的】寻找与绵羊多胎性状相关的DNA标记,为提高绵羊繁殖力的标记辅助选择提供科学依据。【方法】试验以策勒黑羊为主要研究对象,利用PCR-RFLP、DNA测序等技术,对BMPR-IB、MTNR1A和PTGS2基因的遗传多态性进行研究。【结果】策勒黑羊BMPR-IB基因具有多态性,存在三种基因型:++、B+和BB;MTNR1A和PTGS2基因不存在多态。【结论】验证了BMPR-IB基因的A746G突变位点是策勒黑羊多胎性的主效基因,而MTNR1A和PTGS2基因与策勒黑羊繁殖性能关系不大。

MTNR1A基因多态性与绵羊季节性繁殖的相关性分析

为研究MTNR1A基因多态性与绵羊季节性繁殖的关系,以季节性发情的阿勒泰羊和常年发情的湖羊为研究对象,分别随机选择2品种羊的基因组各50份混合构建DNA池,并以此为模板扩增绵羊MTNR1A基因5′侧翼序列、ExonⅠ及ExonⅡ,通过测序检测MTNR1A基因在阿勒泰羊和湖羊群体的突变。在对突变进行分析的基础上,于5′侧翼序列选择2处转录因子结合的突变位点,利用PCR-SSCP技术检测其在200只阿勒泰羊和210只湖羊中的多态性分布,并分析其与绵羊季节性繁殖性状的关联性。结果表明,MTNR1A基因5′侧翼序列、ExonⅠ及ExonⅡ在阿勒泰羊和湖羊群体中分别检测到18、1和9处突变,TF Search和Signal Scan分析显示,5′侧翼序列的18处突变中有4处分别处于转录因子TBP、GR、SP1和c-Myb的结合位点处,预测评分分别为98.5、95.2、97.6和94.9。ExonⅠ及ExonⅡ中检测到的10处突变中,有4处突变为错义突变,6处突变为同义突变,但均不在MTNR1A的跨膜区。PCR-SSCP检测结果显示,g.15143697位点的T/C突变在湖羊群体中以CC基因型为主,其基因型频率达到0.919,而在阿勒泰羊中以TT基因型为主,基因型频率为0.950,阿勒泰羊群体中T等位基因的比例为湖羊群体的550倍,推测该位点可能与绵羊的季节性发情有关。

不同繁殖状态阿勒泰羊下丘脑MTNR1A基因表达变化与其季节性繁殖的关系

【目的】分析不同繁殖状态阿勒泰羊下丘脑褪黑素受体1A(MTNR1A)基因表达情况与其季节性繁殖之间的关系,为深入研究绵羊季节性繁殖的调控机理奠定基础。【方法】采用RT-PCR对发情盛期阿勒泰羊不同组织中的MTNR1A基因表达情况进行检测,并以q RT-PCR测定分析乏情期及发情初期、发情盛期、发情末期和间情期阿勒泰羊下丘脑MTNR1A基因的表达变化情况。【结果】MTNR1A基因在发情盛期阿勒泰羊的下丘脑、垂体、卵巢和脾脏中高表达,而在心肌、肺脏和骨骼肌中不表达或表达量极低。秋季发情季节阿勒泰羊下丘脑中MTNR1A基因的表达量极显著高于夏季乏情季节(P<0.01),但在发情前期、发情盛期、发情末期和间情期的表达量差异不显著(P>0.05);夏至后20 d下丘脑中MTNR1A基因的表达量显著高于夏至前20 d(P<0.05)。【结论】褪黑素及其受体在阿勒泰羊发情启动过程中发挥重要的调控作用。

MTNR1a基因在内蒙古绒山羊下丘脑、垂体及卵巢中的表达

采用RT-PCR和原位杂交方法检测MTNR1a mRNA在内蒙古绒山羊下丘脑、垂体及卵巢中的表达及分布。结果表明,MTNR1a基因在内蒙古绒山羊下丘脑、垂体、卵巢中均有表达,且在下丘脑、垂体组织中呈广泛表达,在卵巢的卵泡膜细胞阳性表达。下丘脑、垂体、卵巢是褪黑激素作用靶器官,阐明褪黑激素对内蒙古绒山羊繁殖力的影响是通过与靶器官受体基因结合发挥其功能,为进一步探讨褪黑激素对内蒙古绒山羊繁殖影响的作用途径及调控机理奠定基础。

MTNR1A基因ExonⅡ T/C突变与绵羊季节性繁殖的关联性分析

【目的】分析MTNR1A基因ExonⅡT/C突变与绵羊季节性繁殖性状的关联性,为深入研究MTNR1A基因在绵羊繁殖活动中的作用机制打下基础。【方法】以季节性繁殖的阿勒泰羊和中国美利奴羊(军垦型)及常年繁殖的湖羊和小尾寒羊为研究对象,采用PCR-SSCP及测序技术检测MTNR1A基因ExonⅡT/C突变在4个绵羊品种群体中的分布情况,并分析其与绵羊季节性繁殖性状的关联性。【结果】MTNR1A基因ExonⅡT/C突变致使MTNR1A蛋白的胞内无规卷曲结构域构象发生变化。在4个绵羊品种群体MTNR1A基因ExonⅡ处均可检测到T/C突变,其中阿勒泰羊和小尾寒羊中以TT基因型为主,T等位基因频率分别为C等位基因的3.4和11.2倍;在中国美利奴羊(军垦型)中则以TC基因型为主,TC基因型频率分别为TT和CC基因型的17.6和19.6倍;在湖羊中3种基因型的分布无明显差异。在阿勒泰羊群体中MTNR1A基因ExonⅡT/C突变位点处于Hardy-Weinberg平衡状态(P>0.05),而在中国美利奴羊(军垦型)、湖羊和小尾寒羊群体中处于极度不平衡状态(P<0.01)。【结论】在季节性繁殖的阿勒泰羊和中国美利奴羊(军垦型)及常年繁殖的湖羊和小尾寒羊群体MTNR1A基因ExonⅡ处均可检测到T/C突变,但该突变与绵羊的季节性繁殖性状无关联。

MTNR1a和MTNR1b在牦牛不同组织中的表达及其在睾丸中的定位

褪黑素对调节季节性繁殖哺乳动物的生殖具有重要调节作用。其受体MTNR1a(Melatonin receptor 1a,褪黑素受体1a)主要参与昼夜节律和生殖调控,MTNR1b(Melatonin receptor 1b,褪黑素受体1b)与多种疾病发生密切相关。为了探讨褪黑素受体基因的生物学功能,本实验对牦牛不同组织中MTNR1a、MTNR1b基因的表达与定位情况进行了研究。采用qRT-PCR(Quantitative Real-Time PCR,qRT-PCR)检测成年雄性牦牛各组织及不同发育阶段(30日龄,2岁、4岁、6岁和8岁龄)牦牛睾丸组织中MTNR1a、MTNR1b mRNA的表达规律,并运用免疫组化技术对不同年龄牦牛睾丸中MTNR1a、MTNR1b蛋白进行了定位研究。结果发现,MTNR1a mRNA在松果体组织中表达量最高,肺脏、肌肉和睾丸次之;随着年龄增加,MTNR1a mRNA在睾丸中的表达量逐渐升高,到4岁后表达量趋于平稳;MTNR1a蛋白在不同发育阶段牦牛睾丸组织中均有表达,圆形精子呈现较强的免疫阳性,其次为初级精母细胞;MTNR1b mRNA在松果体表达量最高(P<0.05),肾脏、肝脏和下丘脑次之;在不同年龄牦牛睾丸中MTNR1b mRNA均有表达,且随着年龄的增加表达量逐渐增加,在8岁时表达量最高;MTNR1b蛋白主要定位在圆形精子细胞中。MTNR1a、MTNR1b基因在牦牛不同组织及不同发育阶段睾丸中的广泛表达,揭示了其在雄性牦牛生殖等生理过程中的重要作用。

MTNR1a和MTNR1b基因在繁殖期与非繁殖期 雄性高原鼢鼠HPG轴上的表达

高原鼢鼠(Eospalax baileyi)终年营地下生活,感光受洞道限制,但褪黑素(Melatonin)分泌水平仍存有季节差异,为探明褪黑素对高原鼢鼠季节性繁殖的调控作用,研究利用q‒PCR技术检测雄性高原鼢鼠繁殖期(5月)和非繁殖期(9月)下丘脑、垂体及睾丸中褪黑素受体1a(Melatonin receptor 1a,MTNR1a)和褪黑素受体1b(Melatonin receptor 1b,MTNR1b)基因mRNA的相对表达量,通过免疫组织化学技术对MTNR1a和MTNR1b在睾丸中定位,并采用Image Pro Plus软件进行免疫组化阳性评价。结果发现,高原鼢鼠繁殖期下丘脑和垂体中MTNR1a基因的相对表达量显著高于非繁殖期的相对表达量(P<0.05),MTNR1b基因的相对表达量在不同时期无显著差异(P>0.05),但非繁殖期睾丸中MTNR1a和MTNR1b基因的相对表达量均显著高于繁殖期(P<0.01);繁殖期除长形精子外的所有类型细胞以及非繁殖期的间质细胞、支持细胞和精原细胞中均观察到MTNR1a的阳性信号,繁殖期除精原细胞和长形精子细胞外的所有类型细胞,以及非繁殖期间质细胞和支持细胞中均观察到MTNR1b的阳性信号,且非繁殖期MTNR1a和MTNR1b的平均光密度值均显著高于繁殖期(P<0.01)。MTNR1a和MTNR1b基因在雄性高原鼢鼠HPG轴上的表达模式,提示了褪黑素在其季节性繁殖调控中的潜在作用。

绵羊MTNR1A基因SNPs筛选及生物信息学分析

目的为了研究绵羊MTNR1A基因结构、多态性,以及其对繁殖功能的影响。方法以高繁殖力的湖羊、多胎萨福克羊和繁殖力相对较低的中国美利奴羊(新疆军垦型)为研究对象,采用PCR方法扩增MTNR1A基因exon2,通过测序和序列比对发现新的SNPs,应用MassARRAY技术对SNPs进行基因分型,通过生物信息学初步分析MTNR1A基因和新SNPs的功能。结果在3个绵羊品种中MTNR1A基因存在8个核苷酸变化(C378T、G405T、G564A、G658A、A735G、A753G、T843C、A845C),其中A658G导致第220位缬氨酸转变为异亮氨酸,A845C导致第282位天冬氨酸转变为丙氨酸。C378T位点在湖羊和多胎萨福克羊中只存在CC基因型和C等位基因,在中国美利奴羊中存在3种基因型,并处于哈代-温伯格不平衡状态;其余7个位点在3个绵羊品种中均存在3种基因型,并处于哈代-温伯格平衡状态,故C378T位点突变可能影响绵羊繁殖性能。生物信息学分析表明,MTNR1A为疏水性蛋白,属视紫红质样G蛋白偶联受体家族,二级结构以α螺旋和无规则卷曲为主。MTNR1A基因突变引起蛋白质二级结构的7处变化,但是没有改变翻译后修饰、拓扑结构以及三级结构。结论该结果为进一步研究MTNR1A基因在绵羊繁殖中的功能,以及多胎绵羊的标记辅助选择育种提供了参考依据。

内蒙古绒山羊MTNR1a基因外显子2克隆及序列分析

依据已发表的绵羊MTNR1a基因外显子2扩增引物序列,以内蒙古绒山羊基因组DNA为模板进行PCR扩增,得到824bp的基因序列,将扩增产物进行克隆测序后与GenBank数据库进行序列同源性比较分析,结果表明,绒山羊MTNR1a外显子2扩增序列与已发表的山羊同源性为99.2%,与绵羊、牛、人、鼠同源性分别为98.5%、96.8%、82.0%和78.4%,内蒙古绒山羊MNTR1a基因第2外显子氨基酸序列与已发表的山羊氨基酸序列的同源性为97.7%,与已发表的绵羊、牛、人和鼠的氨基酸同源性分别为94.1%、91.8%、82.2%、83.1%。

山羊卵巢褪黑素信号特异性载体pcDNA3.1-Pro/GDF9-ASMT与pcDNA3.1-Pro/Cyp17-MTNR1A/B的构建

本研究旨在构建褪黑素(melatonin,MLT)合成酶乙酰血清素甲基转移酶(acetylserotonin methytransferase,ASMT)的卵母细胞特异表达载体GDF9-ASMT和MLT受体(MTNR1A与MTNR1B)的颗粒(黄体)细胞特异表达载体Cyp17-MTNR1A、MTNR1B,以期为进一步生产高繁殖力转基因山羊提供载体材料。首先,分别扩增出山羊生长分化因子9(GDF9)与细胞色素P450家族17亚家族A成员1(Cyp17a1)启动子序列备用;然后,扩增ASMT、MTNR1A及MTNR1B基因CDS全长序列,并通过酶切将ASMT连接至GDF9启动子下游,将MTNR1A和MTNR1B连接至Cyp17a1启动子下游,制备出Pro/GDF9-ASMT、Pro/Cyp17-MTNR1A与Pro/Cyp17-MTNR1B表达元件;最后通过酶切连接将上述表达元件整合至pcDNA3.1(+)载体中,从而构建出pcDNA3.1-Pro/GDF9-ASMT、pcDNA3.1-Pro/Cyp17-MTNR1A和pcDNA3.1-Pro/Cyp17-MTNR1B真核表达载体。经测序验证,本研究扩增出的GDF9和Cyp17a1启动子长度分别为2496和2497 bp,与GenBank数据库中山羊GDF9和Cyp17a1基因起始密码子上游2500 bp区域的同源性均为98%;扩增出的ASMT、MTNR1A与MTNR1B的CDS序列长度分别为1037、1100和1130 bp,与GenBank所递交的标准序列同源性分别为98%、98%和99%,氨基酸序列同源性分别为97%、98%和99%。上述载体的成功构建可为进一步生产褪黑素高繁殖力转基因山羊提供参考。

和田羊卵巢中MTNR1a基因的表达及序列分析

为了研究和田羊MTNR1a基因结构、多态性及与其他物种的同源性,根据Gen Bank中绵羊的MTNR1a(登录号为NM001009725)基因序列,以Primer 5.0和DNAMan软件设计引物后,通过提取和田羊卵巢总RNA,并将其反转成c DNA,采用qRT-PCR技术,以c DNA为模板,利用PCR扩增得到350 bp的基因片段。将扩增产物进行纯化和测序分析后,与Gen Bank数据库中其他物种的MTNR1a基因序列进行同源性比较。结果表明:和田羊MTNR1a基因与已发表的绵羊属Chokla、Musimon和Patanwadi(登录号分别为KC727711、FJ801038、KJ865682)三个品种羊的同源性均高于98%;与牦牛、野牛、牛、山羊和藏羚羊(登录号分别为KF569810、XM010835821、U73327、KC865680、KJ005972610)的同源性为96%~98%。

内蒙古绒山羊下丘脑中MTNR1a基因的表达

本试验从内蒙古绒山羊下丘脑中提取总RNA,根据已发表的相近物种MTNR1a序列设计引物,利用逆转录多聚酶链式反应技术及组织原位杂交技术检测褪黑素受体基因MTNR1a在内蒙古绒山羊下丘脑中的表达及其分布,结果显示:MTNR1a基因在内蒙古绒山羊下丘脑中广泛表达,说明下丘脑是褪黑激素作用的靶器官。结果提示:褪黑激素对绒山羊季节性繁殖的影响有可能与下丘脑分泌的某些激素相互作用而发挥其生物学功能的。

5个绵羊群体MTNR1A基因的多态性与产羔数的关联分析

为探究绵羊MTNR1A基因在5个绵羊群体之间的多态性与基因功能,本研究以杜泊羊、滩寒羊、杂一代、杂二代、横交一代5个绵羊群体为研究对象,利用飞行质谱检测技术对5个绵羊群体MTNR1A基因g.15118428T>C、g.15118664G>T、g.15119130C>T共3个错义突变位点进行检测,并利用相关生物信息学软件预测分析该基因编码蛋白的理化性质、结构和蛋白互作等。结果表明,MTNR1A基因g.15118428T>C和g.15118664G>T这2个位点在5个群体中均为低度多态(PIC<0.25),g.15119130C>T位点在5个群体中均表现为中度多态(0.25<PIC<0.5)。对3个位点的不同基因型与5个群体的产羔数进行关联分析,结果表明各基因型与产羔数间差异均不显著,说明这3个位点不适用于5个绵羊群体的多羔性状的选育。通过生物信息分析表明,绵羊MTNR1A蛋白理论等电点为9.58,脂肪系数为115.77,总平均亲水性为0.598,为稳定的疏水性碱性蛋白,3个位点突变前后MTNR1A基因编码蛋白二级结构均发生变化,本研究为绵羊繁殖力的标记辅助选择和育种提供一定的理论依据。

褪黑素对围绝经期失眠的作用效果及机制

目的:探究褪黑素(MEL)治疗在去卵巢与对氯苯丙氨酸诱导大鼠围绝经期失眠中的效果和作用机制。方法:采用MEL给予围绝经期失眠模型大鼠处理。采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测外周血MEL、褪黑素受体1A(MTNR1A)、蛋白激酶A(PKA)、细胞外调节蛋白激酶(ERK1/2),磷酸化蛋白激酶A(p-PKA)和磷酸化细胞外调节激酶(p-ERK1/2)水平。实时荧光定量(qRT-PCR)检测MTNR1A,PKA和ERK1/2基因表达。Western印迹检测PKA、ERK1/2,p-PKA和p-ERK1/2蛋白的表达。免疫组织化学法(IHC)检测大鼠脑组织MTNR1A蛋白的表达。结果:围绝经期失眠大鼠给予褪黑素可使动物睡眠潜伏期下降,持续时间增加,且寻找平台等待时间减少,以及外周血褪黑素水平升高。此外,褪黑素处理还可上调围绝经期失眠大鼠大脑皮质中MTNR1A基因和蛋白表达,促进PKA-ERK1/2通路在大脑皮质的磷酸化。结论:褪黑素通过上调MTNR1A的表达激活PKA-ERK1/2途径缓解去卵巢与对氯苯丙氨酸诱导的大鼠围绝经期失眠。

MTNR1B基因突变合并胰岛素受体基因突变1例家系报道

近年来全球糖尿病的发病率逐年提高,虽然临床上可供选择的降糖药层出不穷,但在临床工作中仍会遇到一些比较棘手的病例,即使尝试多种降糖方案后治疗效果仍不理想。基因诊断技术的发展日新月异,为进一步寻找这些患者的病因提供了有力支持。笔者发现了1个褪黑激素受体1B(melato-nin receptor 1B,MTNR1B)基因突变合并胰岛素受体(insulin receptor,INSR)基因突变的家系,现报道如下,希望为该类患者的诊治提供新思路。

MTNR1 A基因对大白猪和长白猪产仔数的影响

根据MTNR1A基因在GenBank中的已知DNA序列设计了2对引物,采用PCR-SSCP技术在一个大白猪和长白猪群体中进行单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)检测,发现了一个SNP位点,并对其不同基因型个体PCR回收产物进行测序。测序结果发现该SNP是由于在+159碱基处(GenBank中序列)发生了G→A的同义突变而引起的。并对该SNP与产仔数进行了关联分析,结果表明该SNP对产仔数的影响不显著。

褪黑激素受体1a基因在内蒙古绒山羊垂体中的表达

本试验从内蒙古绒山羊脑垂体中提取总RNA,根据已发表的相近物种褪黑激素受体1a(melatonin receptor 1a,MTNR1a)基因序列设计引物,利用实时荧光定量逆转录多聚酶链反应(real-time quantitative,RT-PCR)技术、组织原位杂交技术检测MTNR1a基因在内蒙古绒山羊垂体中的表达。结果显示,通过RT-PCR方法检测到MTNR1a基因在内蒙古绒山羊垂体中表达,利用原位杂交技术进一步确定MTNR1a基因在垂体中表达分布。结果提示,垂体是褪黑激素作用的靶器官,褪黑激素对绒山羊季节性繁殖的影响有可能是与垂体分泌的某些激素相互作用而发挥作用的。

MTNR1B rs10830963基因多态性对瑞格列奈治疗2型糖尿病患者疗效的影响

目的:研究MTNR1B rs10830963基因多态性对瑞格列奈治疗2型糖尿病(T2DM)患者疗效的影响。方法:选取新诊断的T2DM患者90例,口服瑞格列奈1 mg,一日3次,连续8周,服药前和服药第8周末收集静脉血标本,测定治疗前后人体参数及糖脂代谢相关指标。采用高分辨溶解曲线方法对患者进行MTNR1B rs10830963基因分型。结果:80例患者完成8周随访,CG+GG基因型携带者空腹血糖(FPG)下降幅度、胰岛β细胞功能指数(HOMA-β)升高幅度均小于CC野生型携带者(P<0.05)。结论:MTNR1B rs10830963基因变异与瑞格列奈治疗T2DM的疗效相关,CC基因型携带者疗效更好。

MTNR1B基因多态性与宁夏汉族2型糖尿病患者脂质谱的关系

目的探讨MTNR1B基因多态性与宁夏汉族2型糖尿病患者体内脂质谱的关系。方法依据病例-对照设计方法,采用全自动生化分析仪等技术检测2型糖尿病患者体内脂质谱;应用PCR-RFLP法对宁夏汉族2型糖尿病患者295例、正常对照239例的MTNR1B rs1387153基因多态性进行分析。结果两组人群的MTNR1B rs1387153 C/T位点基因型和等位基因频率比较差异无统计学意义(P>0.05)。三种基因型的TG比较差异有统计学意义(P=0.046),T型等位基因的TG水平高于C等位基因。Logistic回归分析显示与2型糖尿病密切相关的独立危险因素依次是TG(P=0.001)和腰围(P=0.027)。结论 MTNR1B rs138715基因多态性与宁夏地区汉族2型糖尿病不具有相关性,但与TG水平相关。