两个品种山羊MTNR1A基因组织表达差异研究

大部分山羊表现出季节性发情繁殖特点,但其分子遗传机理尚不清楚。近年来,越来越多的研究结果提示,哺乳动物的季节性繁殖与MTNR1A基因有关。为探明山羊MTNR1A基因的作用,采用荧光定量PCR(qRT-PCR)方法对常年发情的济宁青山羊和季节性发情的辽宁绒山羊下丘脑-垂体-卵巢繁殖轴组织中MTNR1A基因mRNA的表达差异进行了对比分析。组织表达谱结果发现,MTNR1A m RNA在两品种山羊的下丘脑、大脑皮层、海马体、卵巢和辽宁绒山羊垂体中均有表达。荧光定量PCR结果分析发现,MTNR1A基因在两品种山羊下丘脑中的表达量较高(P<0.05),在卵巢中有一定的表达,而在垂体中的表达量较低;在辽宁绒山羊下丘脑和卵巢中MTNR1A基因的表达量高于济宁青山羊(P>0.05)。提示MTNR1A基因可能与山羊季节性繁殖调控有关,值得进一步深入研究。

MTNR1A基因多态性与绵羊季节性繁殖的相关性分析

为研究MTNR1A基因多态性与绵羊季节性繁殖的关系,以季节性发情的阿勒泰羊和常年发情的湖羊为研究对象,分别随机选择2品种羊的基因组各50份混合构建DNA池,并以此为模板扩增绵羊MTNR1A基因5′侧翼序列、ExonⅠ及ExonⅡ,通过测序检测MTNR1A基因在阿勒泰羊和湖羊群体的突变。在对突变进行分析的基础上,于5′侧翼序列选择2处转录因子结合的突变位点,利用PCR-SSCP技术检测其在200只阿勒泰羊和210只湖羊中的多态性分布,并分析其与绵羊季节性繁殖性状的关联性。结果表明,MTNR1A基因5′侧翼序列、ExonⅠ及ExonⅡ在阿勒泰羊和湖羊群体中分别检测到18、1和9处突变,TF Search和Signal Scan分析显示,5′侧翼序列的18处突变中有4处分别处于转录因子TBP、GR、SP1和c-Myb的结合位点处,预测评分分别为98.5、95.2、97.6和94.9。ExonⅠ及ExonⅡ中检测到的10处突变中,有4处突变为错义突变,6处突变为同义突变,但均不在MTNR1A的跨膜区。PCR-SSCP检测结果显示,g.15143697位点的T/C突变在湖羊群体中以CC基因型为主,其基因型频率达到0.919,而在阿勒泰羊中以TT基因型为主,基因型频率为0.950,阿勒泰羊群体中T等位基因的比例为湖羊群体的550倍,推测该位点可能与绵羊的季节性发情有关。

不同繁殖状态阿勒泰羊下丘脑MTNR1A基因表达变化与其季节性繁殖的关系

【目的】分析不同繁殖状态阿勒泰羊下丘脑褪黑素受体1A(MTNR1A)基因表达情况与其季节性繁殖之间的关系,为深入研究绵羊季节性繁殖的调控机理奠定基础。【方法】采用RT-PCR对发情盛期阿勒泰羊不同组织中的MTNR1A基因表达情况进行检测,并以q RT-PCR测定分析乏情期及发情初期、发情盛期、发情末期和间情期阿勒泰羊下丘脑MTNR1A基因的表达变化情况。【结果】MTNR1A基因在发情盛期阿勒泰羊的下丘脑、垂体、卵巢和脾脏中高表达,而在心肌、肺脏和骨骼肌中不表达或表达量极低。秋季发情季节阿勒泰羊下丘脑中MTNR1A基因的表达量极显著高于夏季乏情季节(P<0.01),但在发情前期、发情盛期、发情末期和间情期的表达量差异不显著(P>0.05);夏至后20 d下丘脑中MTNR1A基因的表达量显著高于夏至前20 d(P<0.05)。【结论】褪黑素及其受体在阿勒泰羊发情启动过程中发挥重要的调控作用。

MTNR1A基因ExonⅡ T/C突变与绵羊季节性繁殖的关联性分析

【目的】分析MTNR1A基因ExonⅡT/C突变与绵羊季节性繁殖性状的关联性,为深入研究MTNR1A基因在绵羊繁殖活动中的作用机制打下基础。【方法】以季节性繁殖的阿勒泰羊和中国美利奴羊(军垦型)及常年繁殖的湖羊和小尾寒羊为研究对象,采用PCR-SSCP及测序技术检测MTNR1A基因ExonⅡT/C突变在4个绵羊品种群体中的分布情况,并分析其与绵羊季节性繁殖性状的关联性。【结果】MTNR1A基因ExonⅡT/C突变致使MTNR1A蛋白的胞内无规卷曲结构域构象发生变化。在4个绵羊品种群体MTNR1A基因ExonⅡ处均可检测到T/C突变,其中阿勒泰羊和小尾寒羊中以TT基因型为主,T等位基因频率分别为C等位基因的3.4和11.2倍;在中国美利奴羊(军垦型)中则以TC基因型为主,TC基因型频率分别为TT和CC基因型的17.6和19.6倍;在湖羊中3种基因型的分布无明显差异。在阿勒泰羊群体中MTNR1A基因ExonⅡT/C突变位点处于Hardy-Weinberg平衡状态(P>0.05),而在中国美利奴羊(军垦型)、湖羊和小尾寒羊群体中处于极度不平衡状态(P<0.01)。【结论】在季节性繁殖的阿勒泰羊和中国美利奴羊(军垦型)及常年繁殖的湖羊和小尾寒羊群体MTNR1A基因ExonⅡ处均可检测到T/C突变,但该突变与绵羊的季节性繁殖性状无关联。

MTNR1a和MTNR1b在牦牛不同组织中的表达及其在睾丸中的定位

褪黑素对调节季节性繁殖哺乳动物的生殖具有重要调节作用。其受体MTNR1a(Melatonin receptor 1a,褪黑素受体1a)主要参与昼夜节律和生殖调控,MTNR1b(Melatonin receptor 1b,褪黑素受体1b)与多种疾病发生密切相关。为了探讨褪黑素受体基因的生物学功能,本实验对牦牛不同组织中MTNR1a、MTNR1b基因的表达与定位情况进行了研究。采用qRT-PCR(Quantitative Real-Time PCR,qRT-PCR)检测成年雄性牦牛各组织及不同发育阶段(30日龄,2岁、4岁、6岁和8岁龄)牦牛睾丸组织中MTNR1a、MTNR1b mRNA的表达规律,并运用免疫组化技术对不同年龄牦牛睾丸中MTNR1a、MTNR1b蛋白进行了定位研究。结果发现,MTNR1a mRNA在松果体组织中表达量最高,肺脏、肌肉和睾丸次之;随着年龄增加,MTNR1a mRNA在睾丸中的表达量逐渐升高,到4岁后表达量趋于平稳;MTNR1a蛋白在不同发育阶段牦牛睾丸组织中均有表达,圆形精子呈现较强的免疫阳性,其次为初级精母细胞;MTNR1b mRNA在松果体表达量最高(P<0.05),肾脏、肝脏和下丘脑次之;在不同年龄牦牛睾丸中MTNR1b mRNA均有表达,且随着年龄的增加表达量逐渐增加,在8岁时表达量最高;MTNR1b蛋白主要定位在圆形精子细胞中。MTNR1a、MTNR1b基因在牦牛不同组织及不同发育阶段睾丸中的广泛表达,揭示了其在雄性牦牛生殖等生理过程中的重要作用。

MTNR1a和MTNR1b基因在繁殖期与非繁殖期 雄性高原鼢鼠HPG轴上的表达

高原鼢鼠(Eospalax baileyi)终年营地下生活,感光受洞道限制,但褪黑素(Melatonin)分泌水平仍存有季节差异,为探明褪黑素对高原鼢鼠季节性繁殖的调控作用,研究利用q‒PCR技术检测雄性高原鼢鼠繁殖期(5月)和非繁殖期(9月)下丘脑、垂体及睾丸中褪黑素受体1a(Melatonin receptor 1a,MTNR1a)和褪黑素受体1b(Melatonin receptor 1b,MTNR1b)基因mRNA的相对表达量,通过免疫组织化学技术对MTNR1a和MTNR1b在睾丸中定位,并采用Image Pro Plus软件进行免疫组化阳性评价。结果发现,高原鼢鼠繁殖期下丘脑和垂体中MTNR1a基因的相对表达量显著高于非繁殖期的相对表达量(P<0.05),MTNR1b基因的相对表达量在不同时期无显著差异(P>0.05),但非繁殖期睾丸中MTNR1a和MTNR1b基因的相对表达量均显著高于繁殖期(P<0.01);繁殖期除长形精子外的所有类型细胞以及非繁殖期的间质细胞、支持细胞和精原细胞中均观察到MTNR1a的阳性信号,繁殖期除精原细胞和长形精子细胞外的所有类型细胞,以及非繁殖期间质细胞和支持细胞中均观察到MTNR1b的阳性信号,且非繁殖期MTNR1a和MTNR1b的平均光密度值均显著高于繁殖期(P<0.01)。MTNR1a和MTNR1b基因在雄性高原鼢鼠HPG轴上的表达模式,提示了褪黑素在其季节性繁殖调控中的潜在作用。

绵羊MTNR1A基因SNPs筛选及生物信息学分析

目的为了研究绵羊MTNR1A基因结构、多态性,以及其对繁殖功能的影响。方法以高繁殖力的湖羊、多胎萨福克羊和繁殖力相对较低的中国美利奴羊(新疆军垦型)为研究对象,采用PCR方法扩增MTNR1A基因exon2,通过测序和序列比对发现新的SNPs,应用MassARRAY技术对SNPs进行基因分型,通过生物信息学初步分析MTNR1A基因和新SNPs的功能。结果在3个绵羊品种中MTNR1A基因存在8个核苷酸变化(C378T、G405T、G564A、G658A、A735G、A753G、T843C、A845C),其中A658G导致第220位缬氨酸转变为异亮氨酸,A845C导致第282位天冬氨酸转变为丙氨酸。C378T位点在湖羊和多胎萨福克羊中只存在CC基因型和C等位基因,在中国美利奴羊中存在3种基因型,并处于哈代-温伯格不平衡状态;其余7个位点在3个绵羊品种中均存在3种基因型,并处于哈代-温伯格平衡状态,故C378T位点突变可能影响绵羊繁殖性能。生物信息学分析表明,MTNR1A为疏水性蛋白,属视紫红质样G蛋白偶联受体家族,二级结构以α螺旋和无规则卷曲为主。MTNR1A基因突变引起蛋白质二级结构的7处变化,但是没有改变翻译后修饰、拓扑结构以及三级结构。结论该结果为进一步研究MTNR1A基因在绵羊繁殖中的功能,以及多胎绵羊的标记辅助选择育种提供了参考依据。

内蒙古绒山羊褪黑激素受体1a基因外显子1克隆及序列分析

参考GenBank上已发表的绵羊(登录号:15 U14109)、人(登录号:U14108)、牛(登录号:U73327)、鼠(登录号:U52222)等物种褪黑激素受体(melatonin receptor 1a,MTNR1a)基因cDNA序列设计引物,以内蒙古绒山羊基因组DNA为模板进行PCR扩增,得到257 bp的基因片段,将扩增产物进行克隆测序后与GenBank数据库进行序列同源性比较。结果表明,绒山羊MNTR1a基因外显子1序列与已发表的绵羊和牛该基因序列同源性分别为99%和96%,说明所得到的序列为绒山羊MNTR1a基因的外显子1序列。利用DNAStar软件分析,得到该基因序列的257个核苷酸。该序列包括5′UTR 23个核苷酸、翻译起始密码子ATG和N端78个氨基酸编码序列。

5个绵羊群体MTNR1A基因的多态性与产羔数的关联分析

为探究绵羊MTNR1A基因在5个绵羊群体之间的多态性与基因功能,本研究以杜泊羊、滩寒羊、杂一代、杂二代、横交一代5个绵羊群体为研究对象,利用飞行质谱检测技术对5个绵羊群体MTNR1A基因g.15118428T>C、g.15118664G>T、g.15119130C>T共3个错义突变位点进行检测,并利用相关生物信息学软件预测分析该基因编码蛋白的理化性质、结构和蛋白互作等。结果表明,MTNR1A基因g.15118428T>C和g.15118664G>T这2个位点在5个群体中均为低度多态(PIC<0.25),g.15119130C>T位点在5个群体中均表现为中度多态(0.25<PIC<0.5)。对3个位点的不同基因型与5个群体的产羔数进行关联分析,结果表明各基因型与产羔数间差异均不显著,说明这3个位点不适用于5个绵羊群体的多羔性状的选育。通过生物信息分析表明,绵羊MTNR1A蛋白理论等电点为9.58,脂肪系数为115.77,总平均亲水性为0.598,为稳定的疏水性碱性蛋白,3个位点突变前后MTNR1A基因编码蛋白二级结构均发生变化,本研究为绵羊繁殖力的标记辅助选择和育种提供一定的理论依据。