河蟹MTXO细胞的离体培养和细胞学研究

对河蟹眼柄神经分泌细胞的细胞学进行了研究，建立了河蟹眼柄视神经节终髓Ｘ器官 （ＭＴＸＯ）细胞原代培养的实用方法。ＭＴＸＯ神经分泌细胞在添加了谷氨酰胺和常量抗菌素的 Ｌ－１５培养基中表现出快速的再生生长，细胞生长可保持３—５ｄ，维持存活约１８ｄ。在ｐＨ６．８－ ７．８、温度 ２０℃－２８℃及渗透压 ９５０－１１００ｍＯｓｍ条件下，均能存活和生长，但在无 Ｃａ２＋或添 加 Ｃａ２＋通道阻断剂 ＣｄＣｌ２的培养基中不能生长。依据大小、形态、分布和超微结构特征及体外 生长方式区分出Ａ、Ｂ、Ｃ三种不同类型细胞。

中华绒螯蟹眼柄MTXO细胞GABA受体通道研究

采用全细胞膜片钳技术测定了中华绒螯蟹 (Eriocheirsinensis)眼柄视神经节端髓X器官 (MTXO)三种类型神经内分泌细胞对 0 0 1～ 5mmol/Lγ氨基丁酸 (γ aminobutyricacid ,GABA)的反应 ,并结合选择性拮抗剂和激动剂的使用进行了GABA受体研究 .在电流钳模式下 ,依据不同NernstCl-电位 ,三种类型细胞均对GABA产生去极化或超级化反应 .在电压钳模式下 ,GABA激活Cl-通道电流 (IGABA) .IGABA在灌流GABA后约12 0 0ms内激活 ,80 0ms内达到峰值 ,没有明显的脱敏反应 ,反转电位接近NernstCl-电位 .IGABA幅值呈浓度依赖性 ,激活阈值为 0 0 1mmol/L ,约在 0 5mmol/L达到饱和 .药理学实验结果表明 ,中华绒螯蟹眼柄神经内分泌细胞GABA受体是Cl-通道蛋白 ,对Cl-离子通道阻断剂Picrotoxin和Niflumicacid敏感 ,但是对GABAA 受体拮抗剂Bicuculline和GABAC 受体激动剂cis 4 aminocrotonicacid (CACA)和trans 4 aminocrotonic (TACA)均不敏感 .

河蟹眼柄神经分泌细胞离子通道的膜片钳研究

采用全细胞膜片钳技术对培养12～24小时不同形态河蟹眼柄视神经节端髓X器官(MTXO)神经分泌细胞离子通道进行了研究。结果表明 ,河蟹眼柄MTXO中分布的A、B、C三种类型神经分泌细胞均可记录到由内向电流和外向电流组成的正常全细胞电流。内向电流由高电压激活钙离子通道电流 (ICa)和对TTX敏感钠离子通道电流 (INa)组成。ICa 的激活电压为 -30mV,在0～ +20mV电压下达到峰值 ,在 -40mV和 -70mV保持电压下记录的ICa 激活阈值、初始峰值及I -V曲线无明显差别。外向电流明显 ,幅值较大 ,包括对4-AP敏感的快速激活、快速失活钾离子通道电流 (IA)和对TEA敏感的缓慢激活、缓慢失活钾离子通道电流 (Ik)。正常蟹种、二龄成蟹和早熟蟹种MTXO神经分泌细胞均表达电压门控钠、钾、钙离子通道 ,通道电流和电压特征无明显区别。

河蟹眼柄神经分泌细胞钾离子通道的种类和特征

用全细胞膜片钳技术对培养 12～ 2 4h不同形态河蟹眼柄视神经节端髓X器官 (MTXO)神经分泌细胞表达的钾离子通道进行了种类鉴别和特征研究。结果表明 :正常蟹种、 2龄成蟹和早熟河蟹眼柄MTXO中分布的A、B、C三种类型神经分泌细胞外向钾离子通道的种类和电压特征无明显区别 ,均表达对 4 AP敏感的快速激活、快速失活的瞬时钾离子通道电流 (IA)和对TEA敏感的缓慢激活、缓慢失活的慢钾离子通道电流 (Ik)。IA和Ik 的激活电压均为 - 4 0mV ,峰值电流与胞体大小成正比 ,并随刺激电压的升高而快速增加。IA 达到峰值的平均时间为 2 5± 0 6ms ,Ik 几乎至 80ms记录结束时达到峰值。

不同甾醇类物质对河蟹眼柄神经分泌细胞I_(Ca)的影响

采用膜片钳技术测定了不同甾醇类物质对河蟹眼柄视神经节端髓X器官 (MTXO)神经分泌细胞钙离子通道电流 (ICa)的作用 ,探讨河蟹眼柄神经肽类激素分泌和养殖河蟹性早熟的调控机制。结果表明 ,河蟹眼柄MTXO三种类型神经分泌细胞均表达高电压激活L型钙通道 ,激活电压为 - 3 0mV ,+1 0mV达到峰值。甾醇类物质中 ,只有胆固醇对河蟹眼柄B型神经内分泌细胞的钙电流存在抑制作用 ,其作用具有浓度依赖性 ,抑制强度不随时间的延长而加强。 1 μmol L的胆固醇作用 4h可抑制B型细胞 5 0 .49%± 5 .

河蟹眼柄神经内分泌细胞Glu受体研究

作者采用全细胞膜片钳技术测定了中华绒螯蟹 (Eriocheirsinensis)眼柄视神经节端髓X器官 (MTXO)神经内分泌细胞对 0 0 1— 10mmol/L谷氨基酸 (Glu)的反应 ,并结合药理学方法进行了Glu受体研究。结果表明 ,Glu激活A型和B型细胞离子型Cl-通道蛋白受体 ,诱导快速激活、快速失活的配体门控Cl-通道电流 (IGlu)。依据内外液的Cl-浓度比例引发去极化或超极化反应 ,继续施加Glu ,细胞快速出现脱敏反应 ;去除Glu后 ,细胞约需 2 0s恢复对Glu的敏感状态。IGlu幅值呈浓度依赖性 ,量 效关系曲线呈线形 ,激活阈值为 0 0 1mmol/L ,约 5mmol/L达到饱和。河蟹眼柄神经内分泌细胞IGlu明显受到Cl-通道阻断剂picrotoxin(0 5mmol/L)抑制 ;对离子型Glu受体激动剂Quisqualate、Kainate、NMDA、AMPA不敏感。Ibotenicacid(IA)可模拟Glu诱导快速激活、快速脱敏的Cl-电流 ,并与Glu产生交互脱敏作用。Glu和GABA对河蟹眼柄神经内分泌细胞无交叉脱敏和交叉激活作用 ,甘氨酸 (Gly)没有诱导细胞产生任何反应 ,提示中枢神经系统通过Glu和GABA两套系统实现对眼柄神经内分泌系统的精确调控。

中华绒螯蟹眼柄神经内分泌细胞表达ATP敏感钾通道

采用膜片钳技术之内面向外记录模式观察了中华绒螯蟹（河蟹）眼柄视神经节端髓X器官（MTXO）神经内分泌细胞对0-1 mmol/L ATP的反应，发现河蟹眼柄MTXO细胞表达ATP敏感钾通道（KATP）。电生理特征研究结果表明，在细胞膜内外两侧的Ｋ＋浓度均为200 mmol/L时，KATP呈弱的内向整流性，电导为68 pS，有翻转电位。灌流ATP对KATP通道的开放产生浓度依赖性抑制作用，当细胞外液中ATP浓度超过0.1 mmol/L后，去极化刺激不能诱发KATP电流，并且1 mmol/L ATP可明显阻断KATP开放活动。胆固醇等甾醇类物质对河蟹眼柄MTXO细胞KATP无明显的影响，但0.1 mmol/L优降糖可完全阻断KATP的单通道开放。KATP受内源性ATP的调控，在细胞代谢与兴奋性耦联中起重要作用，提示河蟹眼柄MTXO细胞的代谢活动对神经多肽激素的分泌产生了反馈调节作用，胆固醇等甾醇类物质未通过调节KATP的活动调控细胞的分泌活动。结果为阐明甲壳动物眼柄神经多肽激素分泌的调控机制提供了新认识。