高效化学偶联的H1N1灭活病毒核酸适配体比色传感器

以A型H1N1灭活流感病毒为例,建立一种高灵敏、高特异、便于产业化和高生物安全性的快速检测高传染性病原体的方法——磁交联沉淀-纳米金联用(MCP-GNP)比色法。首先,利用磁珠上活化的羧基与灭活病毒表面上蛋白质的一级胺基之间高效的化学偶联实现对灭活病毒的捕获;其次,将核酸适配体与捕获了灭活病毒的磁珠进行孵育,核酸适配体特异性识别H1N1灭活病毒,磁性分离后热洗脱磁珠上结合的核酸适配体;再次,对热洗脱的核酸适配体进行聚合酶链式反应(PCR)扩增;最后,利用纳米金对单链引物和双链扩增产物吸附能力的差异,实现对H1N1灭活病毒的比色检测。以H5N1灭活病毒为阴性对照组,检出限(S/N=3)为1 ng/L,是本课题组之前报道的特异性电化学阻抗传感器检出限的1/900。利用上述方法首次实现了对低病毒载量临床H1N1灭活病毒阳性咽拭子样本的比色检测。未经优化的条件下,从灭活病毒捕获到检测的全流程在3 h内完成,初步展示了其临床应用价值。此外,文中所有比色检测结果均与荧光定量PCR技术的测量结果一致,证实了方法的可靠性。本文的核心创新点是利用化学偶联进行超低质量浓度灭活病毒捕获,无需对病毒核酸进行提取和富集,更加便捷。此外,本研究利用H1N1灭活病毒的DNA核酸适配体实现病毒的特异性检测,不直接检测活病毒,具有高生物安全性。

粮食中AFB_(1)检测方法及核酸适配体技术应用进展

粮食谷物类食品是我国的主要食物,却极易受到真菌毒素的污染。在众多真菌毒素中,黄曲霉毒素B_(1)(AFB_(1))是毒性最高的真菌毒素之一。因此,快速、准确并且能够现场及时地对粮食中的AFB_(1)进行检测,对我国食品安全有着重要意义。本文针对目前粮食中AFB_(1)及其相关限量要求进行了概述,对AFB_(1)的检测方法研究进展进行了综述,重点介绍了新型的核酸适配体传感器技术在此领域的应用,并分析了各方法的优势与不足以供后续研究参考。

黄曲霉毒素B1核酸适配体筛选和检测方法的建立

建立一种高灵敏的快速检测黄曲霉毒素B1(aflatoxin B1,AFB1)的方法。基于氧化石墨烯(graphene oxide,GO)通过π-π共轭吸附单链寡核苷酸(single-strand DNA,ssDNA),对已结合靶标的ssDNA吸附能力较弱的特性,设计针对AFB1核酸适配体的筛选方案。经过10轮筛选,共获得45条ssDNA序列。挑选具有代表性的6条序列进行亲和力分析实验,其解离常数Kd分别为16.29、27.88、18.54、23.11、47.94、22.31 nmol/L。选用亲和力较高的AFB-5、AFB-8进行特异性实验,结果显示所筛选的适配体能特异性吸附AFB1。最后利用适配体AFB-8作为识别元件建立了基于纳米金比色检测AFB1的方法。在优化的检测条件下,AFB1质量浓度与A520 nm值有良好的线性关系,其回归方程为y=-0.00709x+0.46142(R^2=0.9979),线性范围为0.025~10 ng/mL,检出限为0.025 ng/mL。通过特异性实验和对大米样品加标回收实验,加标回收率为83.36%~105.74%,证明本方法的可行性。

伏马毒素B_1核酸适配体链置换探针的筛选及应用

伏马毒素B_1是串珠镰刀菌产生的毒性最强的真菌毒素,主要存在于受污染的玉米及其制品中。本研究采用基于磁分离的固相表面链置换策略和荧光分析法筛选到了FB_1核酸适配体的活性链置换探针,在此基础上开发了玉米中FB_1的荧光偏振检测法并用于实际样品的检测,动态响应范围10 nM^200 nM。该方法为均相检测技术,成本低廉,重现性好,操作简单方便且可实现大量样品的平行检测。

核酸适配体类抗HIV-1药物的研究进展

核酸适配体是指能特异结合蛋白质或其它小分子物质的寡核苷酸片段,可通过对某些酶或蛋白因子的抑制达到抗病毒的目的。近年来,核酸适配体类药物的研发已经取得了进展,尤其是在抗艾滋病病毒方面,此类药物展现出了广阔的临床应用前景。目前,核酸适配体类抗HIV-1药物按作用机制可分为抑制HIV-1逆转录酶的适配体、抑制HIV-1核糖核酸酶H的适配体和抑制HIV-1Tat蛋白介导的反式激活的适配体。介绍这3种核酸适配体类抗HIV-1药物的有关研究情况。

基于铽离子的非标记核酸适配体传感器检测黄曲霉毒素B1

黄曲霉毒素B1(aflatoxin B1,AFB1)具有致癌、致畸和致突变效应,被国际癌症研究机构(IARC)列为一类致癌物,对消费者健康有巨大威胁。当Tb^3+单独存在溶液中时,检测不到其特征荧光;当Tb^3+与单链核酸结合后可形成络合物,使得Tb^3+特征荧光显著增强;当加入靶分子AFB1后,由于AFB1可与核酸适配体结合,从而引起构象变化形成双链,Tb^3+不能与双链核酸结合发光,使得荧光增强得到抑制。本研究基于上述原理构建了一种基于稀土铽离子(Tb^3+)特征荧光效应的非标记核酸适配体传感器,可实现对AFB1的均相快速检测。该方法利用荧光信号的变化对AFB1进行定量分析,检测限为1.84 ng/mL。由于核酸适配体对靶分子识别具有专一性,可以在复杂的基质中准确区分检测出AFB1及其他真菌毒素。在回收率实验中核酸适配体传感器得到的回收率为95.94%~107.12%,验证了该方法的有效性。该检测方法不需要对核酸进行修饰标记,可节约成本,检测全过程操作简单,且不需要分离,在一个洁净的离心管内即可完成,可实现对AFB1的均相检测。

闭锁连接蛋白-1 核酸适配体的筛选与初步应用

基于配体指数富集系统进化技术筛选闭锁连接蛋白-1的核酸适配体,最终筛选到15条ZO-1的核酸适配体(APTZO-1).排除线性结构与相似结构后,采用酶联免疫吸附法表征了9条APTZO-1与ZO-1亲和力的大小,排序依次为:APTZO-18>APTZO-12>APTZO-17>APTZO-113>APTZO-11>APTZO-15>APTZO-115>APTZO-112>APTZO-14.采用Cy5荧光基团标记APTZO-18(Cy5-APTZO-18),证实了其能对人结直肠腺癌细胞(Caco-2)与人脑微管内皮细胞(hCMEC/D3)的ZO-1进行荧光定位与半定量分析,且与基于ZO-1抗体法的免疫荧光与蛋白印迹实验结果基本相似.本研究首次筛选到了ZO-1的系列核酸适配体,有望为ZO-1的荧光标记与半定量分析提供一种新型的、特异性高的工具分子.

基于核酸适配体检测饲料中黄曲霉毒素B_(1)的方法

【目的】建立一种基于核酸适配体检测饲料中黄曲霉毒素B_(1)的方法,为饲料中黄曲霉毒素B_(1)的检测提供技术支撑。【方法】利用FAM荧光标记的核酸适配体与黄曲霉毒素B_(1)的特异性结合,而与偶联BHQ1的互补序列无法配对,导致荧光值变化而实现检测。【结果】在优化条件下,链亲和素浓度为100μg/mL,核酸适配体浓度为250 nmol/L,互补序列浓度为500 nmol/L,黄曲霉毒素B_(1)在0.01~10.0 ng/mL范围具有较好的线性关系,最低检测限为0.01 ng/mL;与黄曲霉毒素B 2、黄曲霉毒素G 1、黄曲霉毒素G 2、桔霉素和赭曲霉素A的交叉反应率均较低,饲料样品中添加黄曲霉毒素B_(1)的平均回收率为91.3%~105.0%。【结论】建立的方法快速、准确、灵敏,选择性好,可用于饲料中黄曲霉毒素B_(1)的分析检测。

基于磁性纳米材料和适配体的荧光传感器检测牛奶中黄曲霉毒素M_1

根据荧光共振能量转移原理,利用磁性纳米材料的磁性分离技术及荧光猝灭能力,构建了基于磁性纳米材料和适配体的荧光传感器,用于高灵敏检测牛奶中黄曲霉毒素M_1(aflatoxin M_1, AFM_1)。标记羧基荧光素(carboxy-fluorescein, FAM)的适配体通过静电作用吸附在Fe_3O_4磁性纳米颗粒表面,并与Fe_3O_4发生能量共振转移,导致荧光猝灭;当体系中存在AFM_1时,适配体与AFM_1特异性识别并形成折叠结构,适配体从Fe_3O_4磁性纳米颗粒表面脱附,使得荧光信号恢复,据此可实现对FAM_1的定量检测。该研究对所制备的Fe_3O_4磁性纳米颗粒进行表征,透射电镜结果表明,Fe_3O_4磁性纳米颗粒粒径在10～15 nm。在优化的实验条件下,该传感器的线性范围为0.05～0.70μg/L,检测限为0.02μg/L。利用荧光传感器检测牛奶中AFM_1的回收率为82.5%～102.3%。

基于核酸杂交反应的荧光生物传感器的制备及在黄曲霉毒素B_1检测中的应用

采用核酸适配体作为特异性识别元件,SYBR Green I(SGI)荧光染料为信号输出单元,构建了黄曲霉毒素B_1(AFB_1)生物传感器,并对试验条件进行了优化。优化的试验条件如下:适配体互补链与适配体的物质的量比为1.5,SGI加入量为10μL,适配体双链与SGI的作用时间为2 min,适配体与AFB_1作用时间为14 min。结果表明,在AFB_1质量浓度为0.1~1 000μg·L^(-1)时,荧光强度变化量与其质量浓度对数呈线性关系,检出限(3S/N)为0.081μg·L^(-1)。对实际玉米样品进行加标回收试验,回收率为95.2%~105%,测定值的相对标准偏差(n=7)均小于6.0%。与其他适配体传感器进行比较,该方法所构建的荧光适配体传感器对AFB_1的检测具有操作简便、检测范围宽、灵敏度高、特异性强、成本低廉等优点,适合现场快速测定。

基于核酸适体检测黄曲霉毒素B 1的方法与高效液相色谱法的对比研究

对基于核酸适体酶联核酸适配体法(酶联适体法)、核酸适配体结构转换荧光法(适体转换荧光法)和高效液相色谱法(HPLC)检测黄曲霉毒素B 1进行对比研究。结果表明:当花生加标量为5、20、60μg/kg时,酶联适体法测得4.27、18.24、56.66μg/kg,适体转换荧光法测得4.95、21.05、65.00μg/kg,高效液相色谱法测得4.62、16.90、48.00μg/kg;当玉米加标量为5、20、60μg/kg时,酶联适体法测得4.05、17.34、50.79μg/kg,适体转换荧光法测得4.05、17.11、50.77μg/kg,高效液相色谱法测得5.10、16.33、44.98μg/kg。统计学分析结果显示,两种基于核酸适体的方法与高效液相色谱法两两之间无显著性差异(P>0.05),且酶联适体法的检测结果具有可视化,核酸适体结构转换荧光法更为直观快捷,为探索黄曲霉毒素B 1的快速检测方法奠定了基础。

适配体功能化二氧化钛基复合光催化剂选择性降解黄曲霉毒素B_(1)作用研究

为了探究可高效、选择性降解食品中黄曲霉毒素B_(1)(AFB_(1))的方法,采用核酸适配体(aptamer)对磁性氧化石墨烯复合二氧化钛(MGO/TiO_(2))光催化剂材料进行选择性修饰,合成适配体功能化MGO/TiO_(2)光催化复合材料(MGO/TiO_(2)-aptamer),并考察了该光催化剂对AFB_(1)的降解效果及其特异性,探究不同因素对MGO/TiO_(2)-aptamer降解AFB_(1)的影响。结果表明:TiO_(2)与Fe_(3)O_(4)颗粒相对均匀地附着在MGO片层表面,且傅里叶红外光谱显示适配体的骨架、碱基以及CO—NH键特征峰,通过透射电镜发现Ti、Fe元素以及aptamer特有的N、P元素,表明适配体功能化MGO/TiO_(2)材料成功合成;与未修饰的MGO/TiO_(2)材料相比,MGO/TiO_(2)-aptamer对低质量浓度AFB_(1)和混合毒素中AFB_(1)的降解率显著提高,验证了其对低质量浓度毒素的降解增强效果以及选择性降解性能。在优化条件下,当MGO/TiO_(2)-aptamer添加量为6 mg,在pH 3的环境中使用紫外可见光照射120 min后,AFB_(1)降解率可达98.3%,且AFB_(1)的光催化降解遵循Langmuir-Hinshelwood准一级动力学模型。

基于金属有机框架的荧光适配体传感器检测红酒中黄曲霉毒素B_(1)

该文利用金属有机框架(Metal-organicFramework,MOF)材料和荧光标记的核酸适配体构建一种基于光诱导电子转移的荧光适配体传感器用于黄曲霉毒素B_(1)(AflatoxinB_(1),AFB_(1))的检测。MOF材料为氨基功能化的奥斯陆大学66(Amino-functionalized University of Oslo66,UiO-66-NH_(2)),标记有四甲基罗丹明(Tetramethylrhodamine,TAMRA)荧光团的核酸适配体(TAMRA-aptamer)通过π-π堆积作用吸附于UiO-66-NH_(2)表面,由于光诱导电子转移使TAMRA-aptamer的荧光猝灭。加入目标物AFB_(1)后,核酸适配体与AFB_(1)特异性识别并结合,使核酸适配体从单链结构转变为稳定的内环结构。由于内环结构与UiO-66-NH_(2)之间的结合能力较弱,光诱导电子转移被阻断,TAMRA-aptamer荧光恢复。该荧光适配体传感器用于AFB_(1)检测,在1.00~100.00 ng/mL范围内荧光信号强度与AFB_(1)浓度具有良好的线性相关性,相关系数的平方(R^(2))为0.994,检测限为0.50ng/mL。该方法用于红酒中AFB_(1)的测定,样品添加回收率为90.00%~101.00%。该方法操作简便、成本低、选择性好、灵敏度高,可用于红酒中AFB_(1)的快速检测。

基于适配体亲和磁珠的黄曲霉毒素B_1单样本前处理试剂盒的制备及应用

黄曲霉毒素B_1(aflatoxin B_1,AFB_1)适配体共价偶联于磁珠表面制备适配体亲和磁珠(aptamer affinity magnetic beads,AAMB),将AAMB、孵育液、洗涤液和洗脱液预封装于试剂条中开发了AFB_1单样本前处理试剂盒,借助真菌毒素全自动净化仪实现了AFB_1前处理的自动化,使用超高效液相色谱仪对洗脱液中AFB_1的含量进行测定。通过优化磁珠粒径、适配体间接臂长度、适配体亲和磁珠用量、孵育液体积确定了AAMB的制备条件以及AFB_1单样本前处理试剂盒的使用条件,对比了手动和自动两种前处理方式下AAMB回收率的差异。在优化条件下,AFB_1的检出限(limit of detection,LOD)为0.6 ng/mL,玉米和小麦中低、中、高三个水平的加标回收率在92.8%~110.1%之间,日内精密度的相对标准偏差(relative standard deviation,RSD)小于5.1%,日间精密度的RSD为6.7%,具有良好的灵敏度、准确性和重复性;粮油基质(玉米、糙米、花生油和花生酱)中AFB_1成分国家有证标准物质的测定结果在其扩展范围内,具有良好的基质适用性。开发的单样本前处理试剂盒借助真菌毒素全自动净化仪仅需一步操作即可在20 min内自动完成10个样品的前处理,具有时间短、通量高、批次间差异小的优点,在真菌毒素定量检测方面具有良好的应用前景,为开发针对其它靶标的自动化前处理方法奠定了基础。

肝癌血清特异标志物Dickkopf-1核酸适体的筛选及其鉴定

目的筛选和鉴定肝癌血清特异标志物Dickkopf-1核酸适体(Apt)。方法采用配体指数级富集系统进化(SELEX)技术,以DKK1为靶蛋白,羧基化琼脂磁珠为筛选介质,从随机ssDNA文库中筛选出一组能够特异性与其结合的核酸适体。利用生物信息学方法对核酸适体进行序列分析和二级结构预测,表面等离子体共振仪分析测定核酸适体的亲和力。结果经过6轮消减SELEX筛选,次级ssDNA文库与DKK1靶标蛋白的亲和力趋向稳定,将第6轮筛选产物经PCR扩增进行高通量测序。表面等离子体共振仪检测结果表明,筛选得到的DKK1核酸适体与DKK1的结合解离常数均在纳摩尔级水平,Apt-5的Kd值最小,亲和力最高,Apt-26和Apt-28核酸适体亲和力相对较弱。二级结构预测分析表明,茎环和茎凸环结构为主要的结构形式。圆二色光谱分析结果显示,3个候选核酸适体(Apt-5,Apt-26,Apt-28)能特异形成G-四链体结构识别DKK1靶标蛋白。结论获得了与DKK1靶标蛋白特异性结合的核酸适体,为后续核酸适体的应用研究以及DKK1蛋白功能的研究奠定了基础。

血清淀粉样蛋白1特异性适配体的筛选

目的:筛选血清淀粉样蛋白1(SAA1)特异性核酸适配体。方法:利用磁珠指数富集的配体系统进化技术(Capture-SELEX)技术,靶标蛋白为SAA1,于单链DNA(ssDNA)文库中筛选与SAA1特异性结合的适配体,进行测序。软件分析适配体的一级和二级结构,酶标仪测定OD450值。结果:12轮筛选后,SAA1与ssDNA文库的亲和率由0.4%上升到21.7%;一级结构无同源序列,二级结构的茎环是SAA1与适配体结合的结构基础。结论:采用Capture-SELEX技术从ssDNA文库中筛选得到了SAA1核酸适配体,为预防和治疗感染性疾病提供一定的参考价值。

基于氮掺杂石墨烯及RecJ_(f)核酸外切酶诱导信号扩增的荧光传感器检测伏马菌素B_(1)

伏马菌素B_(1)(FB_(1))是农产品生长过程中主要由镰刀菌产生的水溶性真菌毒素,主要污染以玉米为代表的谷物及制品,能引起家畜急性中毒,损害动物免疫系统,具有潜在的致癌性。设计具有良好分散性的氮掺杂石墨烯(NDGRs),作为负载FB_(1)核酸适配体(Aptamer)识别探针的基底,构建了以RecJ_(f) Exo催化剪切FAM-Aptamer/FB_(1)复合物中单链FAM-Aptamer释放FB_(1)、触发靶标循环实现信号扩增的传感策略,建立简化分析步骤、提高灵敏度与稳定性的新型荧光传感器分析方法,用于FB_(1)的检测研究。与不加酶相比,加入RecJ_(f) Exo的传感器获得的荧光强度增加了80.1%。在0.2~20 ng/mL及20~500 ng/mL范围内,荧光强度与FB_(1)质量浓度呈良好线性关系,检出限为0.084 ng/mL。对加标玉米及加标啤酒样品进行检测,平均回收率分别为91%~103%和92%~97%,说明制备的传感器适用于食品中FB_(1)的检测。

基于荧光染料PicoGreen和核酸适配体的伏马毒素B_1检测方法

伏马毒素B1是主要存在于玉米及玉米制品中的一种可以引起癌症的霉菌毒素。针对霉菌毒素精准检测技术的开发对于保障食品安全至关重要。本研究利用核酸适配体与伏马毒素B1结合后不再结合其互补核酸序列的选择性以及Pico Green与双链DNA结合的特异性,开发了一种快速检测伏马毒素B1的适配体方法。Pico Green与双链DNA反应15 min后激发产生的荧光达到峰值(激发波长为480 nm,发射波长为520 nm)。该方法的最低检测限为0.1μg/L(0.1 ppb),线性范围为0.1-1μg/L(0.1-1 ppb),整个检测流程可在40 min内完成。特异性试验显示伏马毒素B1适配体与黄曲霉毒素B1、赭曲霉毒素、桔毒素和玉米赤霉烯酮等常见霉菌毒素无交叉反应。结果表明适配体方法与基于抗体的检测伏马毒素B1商品化ELISA试剂盒相当,Kappa值为0.857。由于核酸适配体比抗体成本低,检测时间短,因此基于核酸适配体的方法比基于抗体的ELISA方法更具有推广应用价值。

基于核酸适配体的上转换荧光纸基传感器用于测定茶水中的黄曲霉毒素B1

黄曲霉毒素大量存在于花生、玉米、稻米、大豆、小麦和茶叶中,其毒性、致癌力在霉菌毒素中都居首位,是对人类健康危害极为突出的一类霉菌毒素.本研究使用上转换纳米材料为荧光标记物,在其表面修饰可特异性地结合黄曲霉毒素B1的核酸适配体,构建出一种基于竞争法的荧光侧流试纸检测技术.该技术可实现对黄曲霉毒素B1的快速检测,在0.1～100 ng/mL的浓度范围内具有良好的线性度,最低检出限为0.03 ng/mL,并实现了对实际茶水样品的定量检测.该方法灵敏度高、特异性强、适用于现场的快速检测,具有良好的经济价值和应用前景.

MUC1靶向性载药纳米粒的构建及其体外抗肿瘤效应的评估

目的构建MUC1靶向纳米粒,并在体外评估其抗肿瘤效应。方法 采用聚乳酸聚乙醇酸共聚物(PLGA)制备包载紫杉醇的纳米粒,并在表面偶联具有MUC1蛋白靶向性的核酸适配体。紫外分光光度法、动态光散射法测定MUC1靶向载药纳米粒的基本表征;以MUC1过表达的乳腺癌细胞MCF-7为实验组,肝癌细胞HepG2为对照组,用流式细胞仪检验纳米粒的选择性,MTS法评估其杀伤效果和IC50。结果 MUC1靶向载药纳米粒粒径(225.3±9.2)nm,药物包封率83.6%±1.7%,在体外可以特异性地被MUC1+癌细胞摄入,对MCF-7细胞杀伤作用显著强于普通载药纳米粒(P<0.01),IC50为1.52 mg/L。结论 该靶向纳米粒可以在体外特异性地增加MUC1+肿瘤细胞对纳米粒的摄入,降低IC50值,提高抗化疗药物对肿瘤细胞的杀伤效率。