MUC1-1、TLR4在不同程度宫颈病变组织中的表达及临床意义

目的:探讨乳腺型黏蛋白(MUC1-1)、Toll样受体-4(TLR4)在不同程度宫颈病变组织中的表达及临床意义。方法:回顾性选取2019年1月-2020年1月笔者所在医院不同程度宫颈病变患者石蜡标本100例,在疾病类型方面,轻微子宫颈病变9例,慢性宫颈炎9例,CINⅠ13例,CINⅡ13例,CINⅢ12例,宫颈腺癌10例,宫颈鳞癌34例,统计分析MUC1-1、TLR4在不同程度宫颈病变组织中的阳性表达情况。结果:宫颈鳞癌患者MUC1-1阳性表达率高于慢性宫颈炎、CINⅠ、CINⅡ、CINⅢ患者,差异均有统计学意义(P<0.05),均低于轻微子宫颈病变患者,差异均有统计学意义(P<0.05);宫颈腺癌患者MUC-1阳性表达率低于CINⅡ、CINⅢ、宫颈鳞癌患者、轻微子宫颈病变患者,差异均有统计学意义(P<0.05),但与慢性宫颈炎、CINⅠ患者比较差异均无统计学意义(P>0.05)。宫颈鳞癌患者TLR4阳性表达率均高于轻微子宫颈病变、慢性宫颈炎、CINⅠ、CINⅡ、CINⅢ患者,差异均有统计学意义(P<0.05),宫颈腺癌和宫颈鳞癌患者TLR4阳性表达率比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论:MUC1-1、TLR4在不同程度宫颈病变组织中的表达不同,能够为临床的鉴别诊断及预后评定提供有效依据。

黏蛋白1(MUC1)致敏的树突状细胞疫苗体外抗肿瘤实验研究

目的研究以Cp G作为免疫佐剂,应用黏蛋白1(MUC1)致敏树突状细胞(DC)制备疫苗在体外诱导的特异性抗肿瘤作用。方法健康人外周血采用密度梯度离心法,分离外周血单核细胞(PBMC),应用GM-CSF、IL-4、TNF-α等细胞因子体外培养诱导DC,观察细胞形态,并通过流式细胞术检测成熟DC细胞标志物CD80、CD86。再应用Cp G作为免疫佐剂,MUC1作为抗原致敏DC制备疫苗,致敏的DC与T细胞混合培养,观察其诱导T淋巴细胞增殖能力。诱导产生的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)与肿瘤靶细胞以5∶1、10∶1、20∶1的效靶比共孵育,MTT法检测CTL杀伤活性。结果 DC表型检测结果为CD80+细胞占70.4%,CD86+细胞占72.0%,呈现成熟DC表型。MUC1致敏的DC疫苗与淋巴细胞混合培养显示,DC疫苗具有刺激T细胞增殖活化的作用,其中DC+Cp G+MUC1组明显高于MUC1+DC或Cp G+DC组,差异有统计学意义(P<0.01)。DC疫苗诱导产生的特异性CTL对肿瘤细胞的杀伤作用较单独T细胞组或DC组明显增强,差异有统计学意义(P<0.01)。并随着效靶比增大,其杀伤作用呈逐渐增强。结论经Cp G和MUC1致敏的DC疫苗在体外可诱导产生特异性抗肿瘤免疫效应。

MUC1的表达与乳腺癌细胞粘附的关系

背景与目的:近年研究认为,肿瘤的转移与肿瘤细胞膜上粘液型糖蛋白的大量形成有关。本实验研究糖基化抑制剂苯甲基-α-N-乙酰半乳糖胺对粘蛋白-1(mucin1,MUC1)形成的抑制作用及其对乳腺癌细胞株MDA-MB-231细胞的粘附、侵袭转移能力的影响。方法:免疫细胞化学法检测MUC1表达,噻唑蓝比色法(MTT)检测细胞对人工基底膜(Matrigel)的粘附能力,明胶酶谱法(zymography)检测MDA-MB-231细胞MMP-2、MMP-9的分泌变化。结果:经苯甲基-α-N-乙酰半乳糖胺去糖基化处理后的肿瘤细胞组与相应对照组比较,MUC1表达降低,对基底膜的粘附力明显降低(P<0.01),同时细胞中MMP-2和MMP-9的分泌量显著下降。结论:MUC1表达水平与肿瘤细胞的粘附能力相关,MUC1的抑制使乳腺癌MDA-MB-231细胞粘附能力,分泌Ⅳ型胶原酶能力明显减弱。

半乳糖凝集素-3和黏蛋白-1在大肠癌中的表达及意义

目的研究半乳糖凝集素-3(galectin-3,Gal-3)和黏蛋白-1(mucin-1,MUC1)在大肠癌组织及癌旁组织中的表达及意义。方法收集我院2009年12月至2010年6月手术治疗的大肠癌标本45例,另取癌旁非肿瘤组织20例作为对照组。用免疫组织化学SP法检测Gal-3和MUC1的表达,并分析其与临床病理的关系。结果 Gal-3在癌旁组织、大肠癌中阳性表达率分别为15.0%、73.3%,大肠癌中Gal-3表达明显高于癌旁组织(P<0.05);无淋巴结转移者Gal-3的阳性表达率为61.5%(16/26);有淋巴结转移者阳性表达率为89.5%(17/19),差异有统计学意义(P=0.0363)。MUC1在癌旁组织、大肠癌中阳性表达率分别为0.0%、54.5%,大肠癌中MUC1明显高于癌旁正常组织(P<0.05);无淋巴结转移者MUC1的阳性表达率为34.6%(9/26);有淋巴结转移者阳性表达率为84.2%(16/19),表达差异有统计学意义(P=0.0009)。结论大肠癌中Gal-3和MUC1表达高于癌旁组织,提示其可能参与了肿瘤的发生;Gal-3和MUC1在有淋巴结转移者的表达高于无淋巴结转移者,提示其可能与大肠癌转移相关。

黏蛋白1多肽通过small MUC1蛋白抑制肿瘤细胞生长

目的:探讨黏蛋白1(mucin1,MUC1)串联重复序列多肽(简称黏蛋白1多肽,MUC1多肽)对肿瘤细胞生长抑制的作用机制。方法:MUC1多肽与多种肿瘤细胞Jurkat、Raji、U937、MCF-7、SMMC7721及活化的T细胞、小鼠巨噬细胞RAW264.7共同培养,观察MUC1多肽对上述细胞生长的影响;建立BABL/c小鼠Jurkat细胞皮下移植瘤动物模型,应用MUC1多肽进行治疗;采用GST免疫沉降实验鉴定与MUC1多肽结合的肿瘤细胞表面蛋白。结果:MUC1多肽对Jurkat、Raji、U937、MCF-7和SMMC7721细胞的生长均有抑制作用,对活化的T细胞和小鼠RAW264.7细胞生长无明显抑制作用。MUC1多肽对BABL/c小鼠皮下Jurkat细胞移植瘤的生长均有明显抑制作用(P<0.05)。GST免疫沉降实验显示,Jurkat和MCF-7细胞裂解上清中与MUC1多肽结合的蛋白可与两种抗MUC1串联重复序列抗体(GP1.4和HMPV)及抗胞内段抗体(Ab5)发生反应,相对分子质量大约115000,提示可能是MUC1新的同种型,命名为smallMUC1(sMUC1)。结论:MUC1多肽可通过与肿瘤细胞表面smallMUC1蛋白的相互作用向细胞传导生长抑制信号。

CpG联合MUC1增强人外周血树突状细胞功能的实验研究

目的:观察Cp G联合黏蛋白1(MUC1)应用对树突状细胞(DC)刺激T细胞增殖作用的影响。方法:应用淋巴细胞分离液分离人外周血单核细胞,体外培养应用GM-CSF、IL-4、TNF-α等细胞因子诱导DC,观察细胞形态,并通过流式细胞术检测细胞标志物CD80、CD86。收获DC按如下分组:A:DC;B:DC+Cp G;C:DC+MUC1;D:DC+Cp G+MUC1;E:Cp G+MUC1,分别与T淋巴细胞混合培养,通过MTT法检测T细胞增殖情况。结果:DC表型检测结果为:CD80^+细胞占70.4%,CD86^+细胞占72.0%,呈现成熟DC表型。MUC1与DC联合疫苗与淋巴细胞混合培养显示:DC具有刺激T细胞增殖的作用,Cp G+DC组和MUC1+DC组,分别较单纯DC组对T细胞的刺激增殖作用明显增强(P<0.01),DC+Cp G+MUC1组又明显高于单用MUC1或Cp G+DC组,差别显著(P<0.01),单纯加Cp G和MUC1(无DC组)则基本无明显刺激T细胞增殖作用。结论:Cp G联合MUC1能明显提高DC促T细胞增殖的功能。

MUC1在HER2阳性乳腺癌发病中的作用及机制研究

目的·研究黏蛋白1(mucin 1,MUC1)在人类表皮生长因子受体2(human epidermal growth factor receptor 2,HER2)阳性乳腺癌发病中的作用及其调控的分子机制。方法·使用病毒感染技术构建MT2/MUC1诱导表达细胞株和MT2/Vec及MT2/CD过表达细胞株;采用蛋白质印迹法(Western blotting)检测过表达MUC1和MUC1-CD后6-磷酸葡萄糖脱氢酶(glucose-6-phosphate 1-dehydrogenase,G6PD)的蛋白质表达水平;通过细胞计数试剂盒8(cell counting kit-8,CCK-8)法、平板克隆形成实验、细胞划痕实验、Transwell迁移实验和肿瘤细胞成球实验,研究MUC1对HER2阳性乳腺癌细胞MT2增殖、克隆形成、迁移和成球的影响;使用GP6D的抑制剂6-AN抑制酶活性,CCK-8检测乳腺癌细胞增殖;采用GEPIA和Kaplan-Meier Plotter数据库分析HER2、MUC1和G6PD在乳腺癌中的表达及其对乳腺癌患者生存期的影响。结果·过表达MUC1或MUC1-CD促进HER2阳性乳腺癌细胞MT2的增殖、克隆形成、迁移和成球,并且提高G6PD的蛋白质表达水平。抑制G6PD活性显著降低MUC1和MUC1-CD诱导的细胞增殖。G6PD蛋白在乳腺癌组织中表达上调且与乳腺癌患者生存期缩短相关。结论·MUC1可能通过调控G6PD的表达促进HER2阳性乳腺癌的进程,提示抑制磷酸戊糖途径可能成为HER2阳性乳腺癌治疗的靶点。

与MUC1共同调控肿瘤化疗耐药的MUCIN家族成员的筛选

目的·在黏蛋白(MUCIN)家族成员中,筛选与黏蛋白1(mucin 1,MUC1)协同调控肿瘤细胞化学治疗(化疗)耐药的蛋白。方法·利用2对细胞系(紫杉醇耐药细胞HeLa229/TR-CasCTL和MUC1敲除细胞HeLa229/TR-CasMUC1,母本细胞HeLa229/P和紫杉醇耐药细胞HeLa229/TR),应用实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,qPCR)技术检测MUCIN家族成员的mRNA表达水平,分析其与MUC1表达的相关性;通过蛋白质印迹法(Western blotting)检测筛选出的MUCIN家族成员的蛋白表达水平,以筛选出在mRNA和蛋白水平均与MUC1表达存在相关性的靶蛋白;通过短发卡RNA(short hairpin RNA,shRNA)方法沉默靶基因,利用药物半抑制浓度(half-maximum inhibitory concentration,IC^(50))实验检测细胞耐药性的变化;进一步利用GEPIA数据库分析多种肿瘤组织中MUC1和MUC13的平均表达水平;采用R2数据库分析在宫颈癌、结肠癌和胰腺癌组织中MUC1与MUC13表达的线性相关性;通过Kaplan-Meier Plotter数据库分析MUC1和MUC13的表达与胃癌患者生存率的关系。结果·qPCR检测结果显示,在MUCIN家族成员中,与MUC1在mRNA水平存在相关性的有MUC13和MUC18;Western blotting检测结果显示,在蛋白水平,只有MUC13随着MUC1的上调而上调,随着MUC1的敲除而下调;IC^(50)实验结果显示,随着MUC13的沉默,肿瘤细胞对紫杉醇的IC^(50)明显下降。进一步利用GEPIA数据库分析发现,在多种肿瘤组织中MUC1与MUC13存在同时高表达或低表达的特点;通过R2数据库分析发现,MUC1和MUC13的表达量在宫颈癌、结肠癌和胰腺癌肿瘤组织中呈正相关;通过Kaplan-Meier Plotter数据库分析发现,MUC1和MUC13的表达量与胃癌患者的生存率呈负相关。结论·MUC1与MUC13在肿瘤细胞化疗耐药中存在协同作用,同时与肿瘤患者的生存预后密切相关;临床上联合抑制MUC1和MUC13在肿瘤细胞化疗耐药治疗上具有可行性。

双抗体间接夹心ELISA法检测血清MUC1蛋白方法的建立及其在肺癌诊断中的应用

目的:建立双抗体间接夹心酶联免疫吸附法(ELISA)试剂盒,检测血清黏蛋白1(MUC1)水平,探讨其在肺癌诊断中的应用,阐明血清MUC1蛋白检测的临床应用价值。方法:在前期制备的MUC1蛋白和兔抗人MUC1多克隆抗体的基础上,建立以鼠抗人MUC1单克隆抗体为包被抗体,兔抗人MUC1多克隆抗体为检测抗体的双抗体间接夹心ELISA方法,并通过对MUC1蛋白标准品的检测,绘制出标准曲线。临床上收集48例肺癌患者、7例肺良性疾病患者和20例健康人的血清,应用本研究建立的ELISA方法检测各组标本血清MUC1蛋白表达水平,绘制ROC曲线,确定最佳cut-off值,得出双抗体间接夹心ELISA方法检测肺癌的敏感度、特异度及约登指数。同时与临床应用的CA15-3试剂盒检测结果进行比较。结果:应用双抗体间接夹心ELISA法确定血清MUC1的临界值为1.98μg.L-1,检测肺癌的敏感度为62.5%,特异度为100%,约登指数为0.625 0。CA15-3试剂盒检测肺癌的敏感度为18.75%,特异度为100%,约登指数为0.187 5。结论:建立的双抗体间接夹心ELISA试剂盒检测肺癌有更高的敏感度和特异度,优于临床常用的CA15-3试剂盒。

黏蛋白1多肽对T淋巴瘤Jurkat细胞生长的抑制及其机制

目的:探讨黏蛋白1(mucin 1,MUC1)多肽对人T淋巴瘤Jurkat细胞生长的抑制作用及其机制。方法:将MUC1多肽与Jurkat细胞共同培养,锥虫蓝染色法观察MUC1多肽对该细胞生长的影响;流式细胞术检测Jurkat细胞生长周期及其细胞表面MUC1的表达;Annexin V/PI双标记法检测Jurkat细胞的凋亡;应用抗体封闭实验检测MUC1多肽在Jurkat细胞表面作用的位点。结果:10、20、40μg/ml MUC1多肽作用使Jurkat细胞生长抑制分别达(32±4)%、(37±2)%、(46±5)%,未见凋亡细胞。流式细胞术检测结果表明MUC1多肽可诱导Jurkat细胞周期阻滞在G0/G1期,在Jurkat细胞表面有MUC1蛋白的表达。采用5μg/ml和25μg/ml抗MUC1抗体封闭Jurkat细胞表面MUC1表位后,MUC1多肽对细胞生长的抑制效应几乎全部消失。结论:MUC1多肽能明显抑制Jurkat细胞生长,其机制与该多肽通过和Jurkat细胞表面MUC1蛋白相互作用导致细胞周期阻滞在G0/G1期有关。

甲状腺结节中TPO mRNA表达与Ret、半乳糖苷凝集素3及黏蛋白1表达的相关性研究

目的探讨甲状腺结节性病变中甲状腺过氧化物酶(TPO)mRNA的表达及与Ret、半乳糖苷凝集素3(Gal-3)和黏蛋白1(MUC1)表达的关系。方法应用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术,对55例甲状腺结节组织的TPOmRNA表达进行了定性检查。用光密度扫描仪测定并计算样品的TPO/β-actin比值,代表TPO mRNA丰度的相对含量。采用免疫组织化学(SP)法,同步进行了Ret、Gal-3和MUC1蛋白的检测。结果55例中,恶性肿瘤TPO mRNA的表达率低于良性病变(P<0.05)。有表达的43例TPO RT-PCR产物的光密度值,良性病变组TPO mRNA明显高于恶性病变组(P<0.01)。Ret、Gal-3和MUC1在良恶性病变间的表达差异有显著性(P均为0.000),恶性病变组明显高于良性病变组。TPO mRNA定性、半定量结果与Ret、Gal-3和MUC1的表达呈负相关(P<0.01或P<0.05);Ret、Gal-3、MUC1互为正相关(P<0.01)。结论甲状腺过氧化物酶mRNA在甲状腺结节的高表达可视为良性病变的标记之一,Ret、Gal-3、MUC1在甲状腺癌有较高的表达率,4种标记物的联合检测有助于甲状腺良、恶性结节的鉴别诊断。

黏蛋白1与肿瘤相关蛋白的调控网络研究

目的·研究黏蛋白1(mucin1,MUC1)在不同肿瘤组织中的表达水平及其对患者生存期的影响;通过分析与MUC1存在相互作用的肿瘤相关蛋白的调控网络,预测MUC1参与肿瘤发生发展的可能机制。方法·使用GEPIA 2在线平台对MUC1在33种肿瘤中的mRNA水平,以及其与患者生存期的关系进行分析。在HEK293T细胞中转染MUC1-HA质粒,用HA抗体进行免疫共沉淀(co-immunoprecipitation,Co-IP)实验,对MUC1结合蛋白进行液相色谱-串联质谱(liquid chromatography-tandem mass spectrometry,LCMS/MS)分析。使用String 11.5在线平台对MUC1结合蛋白的亚细胞定位、分子功能、涉及的疾病、参与的生物学过程以及这些蛋白之间的相互作用调控网络进行分析。结果·MUC1在乳腺癌、宫颈癌、弥漫性大B细胞瘤、多发性胶质细胞瘤、低级别脑胶质瘤、卵巢癌、胰腺癌、胸腺癌和子宫内膜癌等9种肿瘤中高表达;对这9种肿瘤中MUC1表达与生存期的关系分析发现,MUC1表达与生存期呈负相关,其中在乳腺癌、宫颈癌、多发性胶质细胞瘤、低级别脑胶质瘤、胰腺癌和胸腺癌等6种肿瘤中具有统计学意义。质谱分析共检测到526个MUC1结合蛋白,这些蛋白定位于细胞器、细胞质和膜结构最多;主要分子功能包括蛋白结合、离子结合和酶活性等;涉及的疾病有解剖实体性疾病、细胞增殖性疾病、代谢性疾病和癌症等;参与的生物学过程主要包括细胞应激、代谢、发育和生物合成等。MUC1结合蛋白主要参与代谢、癌症、cGMP-依赖cGMP的蛋白激酶(cGMP-dependent protein kinase,PKG)、肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor,TNF)和细胞周期等信号通路;深入分析后发现,MUC1结合蛋白一方面大量参与到Wnt/β-catenin、Notch和cAMP等癌症相关信号通路,另一方面通过调控代谢、凋亡和细胞周期促进肿瘤的发生发展。结论·MUC1在多种肿瘤组织中高表达并与患者预后不良相关;MUC1通过蛋白相互作用参与调控细胞代谢和肿瘤相关信号通路。该研究创新性地发现多个新的MUC1结合蛋白,可为进一步研究MUC1生物学新功能奠定基础。

钼靶和超声多普勒结合血清肿瘤标志物诊断早期乳腺癌研究

目的:探讨钼靶、超声多普勒和血清肿瘤标志物中血清前列腺特异抗原(PSA)、血清糖类抗原15-3(CA153)、黏蛋白1(MUC1)、人类生长分化因子3(GDF3)单独及联合检测在早期乳腺癌诊断中的价值。方法:选取2018年1月至2021年12月在唐山市人民医院经病理检查确诊的96例乳腺癌患者(乳腺癌组)和同期在本院接受诊治的70例乳腺良性疾病患者(良性病灶组)以及同时选取在本院体检健康的50名体检者(健康对照组),以术后病理检查为“金标准”,比较钼靶、超声多普勒检查以及血清PSA、CA153、MUC1、GDF3单独及6者联合应用对乳腺癌的诊断价值。结果:乳腺癌组96例乳腺癌患者中有78例乳腺超声诊断为恶性,阳性检出率为81.3%;80例钼靶X射线检查诊断为恶性,阳性检出率为83.1%;乳腺癌组的血清PSA、CA153、MUC1及GDF3的水平明显高于良性病灶组和健康对照组,差异均有统计学意义(t_(良性病灶组)=8.783、10.361、11.258、18.965;t_(健康对照组)=9.564、12.658、12.688、20.163,P<0.05);以乳腺癌作为因变量,血清PSA、CA153、MUC1及GDF3为自变量,进行Logistic回归分析,血清PSA、CA153、MUC1及GDF3是乳腺癌的重要危险因素(OR=1.165、1.168、1.472、1.248,P<0.05);受试者工作特征(ROC)曲线分析各指标单独应用时:乳腺超声、钼靶,血清PSA、CA153、MUC1及GDF3的ROC曲线下面积(AUC)(95%CI)、灵敏度和特异度分别为0.723(0.595~0.851)、82.56%和67.32%,0.761(0.636~0.886)、85.79%和65.36%,0.833(0.726~0.941)、81.48%和85.73%,0.837(0.738~0.926)、61.25%和70.17%,0.768(0.648~0.889)、71.49%和80.87%,0.613(0.469~0.758)、52.94%和50.57%;而6项联合应用时AUC(95%CI)、灵敏度和特异度分别为0.958(0.905~0.999)、96.37%和84.83%,其诊断效能更高。结论:钼靶、超声多普勒和血清PSA、CA153、MUC1、GDF3联合检测效能高于单独检测,有助于早期鉴别和诊断乳腺癌。

一种靶向MUC1及PD-1的双靶点蛋白疫苗设计及其体液免疫学分析

机体内存在肿瘤免疫抑制是MUC1等肿瘤相关性抗原疫苗临床效果不佳的重要原因,我们认为减少免疫抑制将能够增强免疫应答。因此,我们以霍乱毒素B亚基为载体,设计了一种同时靶向小鼠MUC1（Muc1）VNTR区和小鼠程序性死亡受体（m PD-1）的融合蛋白疫苗并研究了其体液免疫学效果。通过插入突变的方法,将Muc1 VNTR序列插入CTB序列以替换其Q56~D59位氨基酸得到CTB-Muc1融合基因,进一步将m PD-1融合至CTB-Muc1的羧基端得到CTB-Muc1-m PD1融合基因,并经TG1大肠杆菌表达,亲和层析得到CTB-Muc1-m PD1的融合蛋白。融合蛋白辅以铝佐剂和Cp G ODN免疫BALB/C小鼠,并收集抗血清,以Elisa法检测抗体产生情况。结果表明：CTB-Muc1-m PD1重组蛋白能够打破小鼠自身免疫耐受,同时产生针对于Muc1和m PD-1的特异性抗体,此外,CTB-Muc1融合m PD-1后能够显著增强机体针对于Muc1的特异性免疫应答（p〈0.01）。这表明靶向抑制免疫环境抑制因子能够显著增强肿瘤相关性抗原的免疫应答。

腺病毒5型和7型感染诱导呼吸道上皮细胞黏蛋白1表达的差异性研究

目的为探讨人类呼吸道腺病毒感染自限性的分子机制，对人类常见呼吸道腺病毒5型（AdS）和7型（Ad7）感染对呼吸道上皮细胞抑炎分子——黏蛋白1（MUC1）表达的影响进行初步研究，并探讨两者差异性。方法分别用Ad7和AdS感染呼吸道上皮细胞A549构建感染模型。qRT-PCR和Westernblot分别检测感染后MUC1mRNA转录水平及蛋白表达水平变化。结果Ad5感染A549细胞后MUCImRNA转录水平及MUC1蛋白表达水平均可见上调，且呈一定的时间效应；而Ad7感染后未观察到此现象，延长Ad7感染时间后，仍未观察到MUC1mRNA转录上调。结论人类呼吸道AdS感染呼吸道上皮细胞初期，可诱导上调抑炎分子MUC1表达，提示MUC1全部或部分参与到Ad5感染的自限性过程。但Ad7感染不能诱导上调MUC1表达，其感染的自限性来源于其他机制。