CORM-2通过PKCθ/Munc18a信号途径抑制脓毒症血小板α颗粒的释放

目的:探讨θ型蛋白激酶C(PKCθ)/Munc18a信号途径介导的脓毒症时血小板α颗粒释放及外源性一氧化碳释放分子Ⅱ(CO-releasing molecules-2,CORM-2)的干预机制。方法:采集健康成年人肘静脉血,差速离心法分离出血小板,随机分为正常对照组,脂多糖刺激组,无活性的CORM-2(i CORM-2,50μmol/L)组,CORM-2(10μmol/L)组,CORM-2(50μmol/L)组。为进一步探讨PKCθ的功能,设立脂多糖+AEB071组和脂多糖+CORM-2(50μmol/L)+AEB071组接受PKCθ抑制剂AEB071(50 nmol/L)干预。随后采用ELISA法检测各组血小板α颗粒释放的血小板源性生长因子BB(platelet-derived growth factor BB,PDGF-BB)和MMP-2,流式细胞术检测血小板P-选择素的表达;免疫荧光法检测血小板α颗粒的分布;同时用蛋白质印迹法检测血小板关键信号分子PKCθ和Munc18a的活性。结果:CORM-2(10、50μmol/L)干预能够有效抑制脂多糖刺激后血小板P-选择素、PDGF-BB和MMP-2的释放(均P<0.05)。免疫荧光检测结果显示CORM-2能抑制脂多糖刺激后血小板α颗粒的释放。脂多糖刺激后血小板PKCθ和Munc18a的磷酸化水平在AEB071组与CORM-2(50μmol/L)组均明显降低(均P<0.05)。结论:CORM-2的干预能够有效地抑制脓毒症时血小板α颗粒的异常释放,其机制可能涉及PKCθ/Munc18a信号途径。

Syntaxin1A与Munc18a在细胞内的相互作用和定位研究(英文)

Syntaxin 1A (Syn1A) 和Munc18a蛋白在囊泡转运和分泌中起着至关重要的作用,然而它们在细胞中分选和转运的分子机制目前尚不清楚. 我们用绿色荧光蛋白(EGFP) 和红色荧光蛋白(TDimer2) 分别标记Syn1A和Munc18a,并用荧光显微技术观察它们在BHK-21和HEK293细胞中的转运和定位. 实验结果表明Syn1A主要定位在细胞质膜上,而Munc18a主要分布在胞浆中,但是与Syn1A共表达时能定位到细胞质膜上. 删除胞浆部分的Syn1A蛋白不能上膜,提示其胞浆结构域在分选和定位过程中起着重要的作用.

CormⅡ对脓毒症血小板α颗粒释放的影响及作用机制

目的探讨外源性一氧化碳释放分子(Corm)Ⅱ对脓毒症时血小板α颗粒(PLT-α)释放的影响及作用机制。方法采集健康供血者空腹外周静脉血并分离血小板,通过脂多糖体外诱导建立脓毒症血小板异常活化模型。分为空白对照组、脂多糖组、无活性CormⅡ组、10μmol/L和30μmol/L CormⅡ组,另再设PKCδ抑制剂(LY317615)组(10μmol/L脂多糖+100 nmol/L LY317615)、CormⅡ+LY317615组(10μmol/L脂多糖+30μmol/L CormⅡ+100 nmol/L LY317615)。采用酶联免疫吸附(ELISA)法检测血小板衍生因子(PDGF)-bb、基质金属蛋白酶(MMP)-2含量,流式细胞术检测血小板P选择素表达;免疫荧光法检测PLT-α分布;Western印迹法检测血小板关键信号分子PKCδ、MUNC18a的表达。结果脂多糖诱导后PLT-α释放的PDGF-bb、MMP-2及血小板P选择素表达水平均明显高于空白对照组,差异有统计学意义(P<0.05);无活性CormⅡ组PLT-α内容物释放及血小板P选择素表达水平与脂多糖组之间差异无统计学意义(P>0.05);CormⅡ诱导后,PLT-α释放的PDGF-bb、MMP-2明显减少,血小板P选择素表达水平明显降低且呈剂量依赖性。脂多糖诱导后中央区的PLT-α逐渐向血小板磷脂膜区转移,与磷脂膜融合后释放到血小板外;无活性CormⅡ组与脂多糖组PLT-α分布情况相似;CormⅡ诱导后血小板α颗向血小板膜汇聚明显减少。脂多糖诱导后血小板p-PKCδ、p-MUNC18a的相对表达量明显高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05);LY317615组、CormⅡ组、CormⅡ+LY317615组板p-PKCδ、p-MUNC18a的相对表达量与脂多糖组和无活性CormⅡ组相比明显降低,差异有统计学意义(P<0.05)。结论 CormⅡ可通过释放的CO活化PKCδ/MUNC18a信号通路,抑制脓毒症时PLT-α的异常释放,减弱脓毒症损伤。

Sec1/Munc18蛋白的研究进展

大多数细胞包含许多种转运到不同目的地的囊泡。尽管存在许多特定的转运途径,根本的分子原则非常相似并在进化中保守。有充足的证据表明,膜融合除需要SNARE蛋白家族的参与外,也需要Secl/Munc18(SM)蛋白;但是与SNARE蛋白功能的一致清楚相反,不同的实验系统得到的不同研究数据,使人们对于不同的SM蛋白的确切作用、作用位点和它们与SNARE蛋白的作用方式持不同观点。不同的SM蛋白与SNARE蛋白存在三种不同的作用模式。最近的研究确定,Munc18-1直接促进融合,并且它可能以所有三种模式与SNARE蛋白相互作用。本文综述了该领域的最新研究进展。

GST-hMunc18-1融合蛋白表达载体的构建及其在原核细胞中的表达

目的:构建hMunc18-1的原核表达载体并诱导、纯化和鉴定其表达。方法:从人HEK293细胞中提取mRNA,反转录为cDNA。用PCR方法扩增出hMunc18-1基因全长,通过EcoRⅠ和XhoⅠ酶切位点将其定向插入pGEX-6p-1载体中,构建原核表达质粒pGEX-6p-1-hMunc18-1。异丙基β-D硫代半乳糖苷(IPTG)在E.coli BL21大肠杆菌中诱导GST-hMunc18-1融合蛋白表达,利用Glutathione Sepharose 4B纯化诱导的融合蛋白,并经Western Blot鉴定结果。结果:hMunc18-1编码序列克隆至pGEX-6p-1载体中,双酶切鉴定片段大小为1785 bp,在E.coli BL21中IPTG诱导融合蛋白的表达,分子质量约为67 000 Da,成功纯化出GST及GST-hMunc18-1蛋白,Western Blot检测到蛋白表达。结论:成功地构建了hMunc18-1基因原核表达载体,证实了其在原核细胞大肠埃希菌中的表达,为进一步纯化Munc18-1及研究其结构与功能奠定了基础。

人类Munc18-1重组质粒的构建及蛋白表达和定位

目的构建人类Munc18-1(hMunc18-1)真核表达质粒pEGFP-hMunc18-1并检测其融合蛋白GFPhMunc18-1在细胞内表达及定位。方法以人胎脑cDNA文库中的cDNA为模板,聚合酶链反应PCR扩增hMunc18-1全长编码基因,亚克隆至绿色荧光蛋白真核表达载体pEGFP-C1中。将构建的重组质粒pEGFPhMunc18-1送到Invitrogen公司进行基因测序,根据NCBI数据库中的hMunc18-1基因序列判断所得重组质粒的基因序列是否正确。将测序正确的质粒pEGFP-hMunc18-1转染到非洲绿猴肾细胞COS-7细胞中,提取细胞蛋白以Western blot法检测融合蛋白GFP-hMunc18-1表达,利用共聚焦激光扫描显微镜观察其在非洲绿猴肾细胞COS-7内的定位。结果 hMunc18-1全长基因序列被成功克隆到绿色荧光蛋白真核表达载体pEGFP-C1中,经酶切后鉴定其片段大小为1785bp。Western blot检测到融合蛋白GFP-hMunc18-1相对分子质量约为94 000,主要分布在细胞质,尤其是细胞膜附近。结论成功构建了hMunc18-1全长基因真核表达质粒pEGFPhMunc18-1,其融合蛋白GFP-hMunc18-1主要定位于COS-7细胞质内,尤其是细胞膜附近。

利用荧光共振能量转移方法研究Snap23和Munc 18C在CHO细胞中的相互作用

目的研究突触小体相关蛋白(snaptosome associated protein of 23 KD,Snap23)与Munc 18C蛋白的相互作用。方法从人肌肉组织中钓取人Snap23基因并克隆入pEYFP-N1载体中,构建pEYFP-Snap23质粒,瞬时转染入CHO细胞后荧光显微镜观察并拍照,免疫蛋白印迹检测EYFP-Snap23蛋白的表达。共转染pEYFP-Snap23和PECFP-Munc 18c质粒,利用荧光共振能量转移的方法检测二者是否有相互作用,同时共转染pEYFP-Snap23和pECFP-N1作为对照组。结果成功构建pEYFP-Snap23载体,荧光共振能量转移实验证明Snap23与Munc 18C蛋白有相互作用。结论突触小体相关蛋白Snap23可能与Munc 18C相互作用。

成年期甲减大鼠海马Munc18表达及甲状腺素的治疗效应

目的观察成年期甲状腺功能减退症(简称甲减)大鼠海马神经突触前膜胞内蛋白Munc18表达及常规剂量和大剂量替代治疗后的变化。方法用丙基硫氧嘧啶(PTU)建立成年期大鼠甲减及治疗模型,放射免疫法测定血清甲状腺素水平,免疫组织化学法观察Munc18在大鼠海马结构的表达与分布。结果与正常对照组比较,甲减大鼠血清T3、T4水平减低,差异有统计学意义,常规剂量替代治疗后恢复正常,大剂量替代治疗后升高,差异有统计学意义。免疫组织化学法显示甲减组海马CA3区、齿状回(DG)和CA1区多形层的Munc18平均光密度值减低,常规剂量替代治疗后,仅DG区分子层平均光密度值减低,大剂量替代治疗后,其差异无统计学意义。结论成年期甲减可致海马内Munc18蛋白表达减少,常规剂量甲状腺素替代治疗能使其大部分恢复,大剂量替代治疗能全部恢复。

基于SM蛋白的CHO细胞分泌工程化改造和抗体表达的研究

目的通过构建基于SM基因的分泌工程化改造的CHO-AV-SM细胞株,探讨在悬浮培养条件下,过表达转运蛋白SM基因对分泌蛋白表达的影响。方法首先从人HEK293FT细胞中克隆出sly1和munc18c基因,然后构建含有SM基因的真核表达载体pBSM;随后将pBSM质粒稳定转染入CHO-AV细胞并鉴定,获得了基于SM基因的分泌工程化改造的CHO-AV-SM细胞株;在此基础上对CHO-AV-SM细胞株进行悬浮培养适应,并测定了CHO-AV和CHO-AV-SM细胞株的生长和蛋白表达参数。结果过表达转运蛋白SM基因,CHO-AV-SM细胞株的抗体表达量较CHO-AV抗体表达量提高约75%,且测得第6天细胞数达到最大值,此时CHO-AV的表达量约为45.4μg/ml,CHO-AV-SM的表达量为79.5μg/ml。结论通过构建全抗稳定表达细胞,在细胞中过表达SM基因,并悬浮培养适应,建立了悬浮培养条件下基于转运蛋白过表达的分泌工程改造方法,为转运蛋白改造CHO细胞,提升全抗表达能力提供了有力支持。

年龄、性别对封闭群小鼠脑内Munc18-1含量及血清甲状腺激素水平的影响

目的①探讨年龄、性别对封闭群小鼠(KM、ICR)不同脑区Munc18-1含量的影响;②探讨年龄、性别对封闭群小鼠(KM、ICR)血清甲状腺激素水平的影响;③探讨Munc18-1含量与血清甲状腺激素水平之间的相关性。方法①选取3个年龄段(22月龄老年组、11月龄中年组、6月龄青年组)昆明小鼠和2个年龄段(12月龄中年组、7月龄青年组)ICR小鼠;②应用Western blot检测小鼠嗅球、额叶、顶叶、腹侧海马及背侧海马中Munc18-1和内参蛋白β-actin蛋白的表达。Munc18-1灰度值与β-actin灰度值的比值作为Munc18-1相对含量;②采用放射免疫法检测小鼠血清甲状腺激素水平;③用方差分析、Spearman秩相关检验进行统计学分析。结果①22月龄昆明小鼠背侧海马Munc18-1含量显著高于中年鼠和青年鼠(P<0.05),且以老年雌鼠显著(P<0.05),而中年昆明小鼠与青年鼠之间未发现显著性差异(P>0.05);12月龄ICR小鼠背侧海马Munc18-1相对含量显著高于青年鼠(P<0.05),且以雌鼠显著(P<0.05)。②22月龄昆明小鼠血清FT3、FT4水平显著低于青年鼠(P<0.05),且FT3显著低于中年鼠(P<0.05),以雌鼠显著(P<0.05),而中年与青年鼠之间未发现显著性差异(P>0.05);12月龄ICR小鼠血清FT3水平显著低于青年鼠(P<0.05),以雌鼠显著(P<0.05)。③昆明小鼠和ICR小鼠背侧海马Munc18-1含量均与FT3呈负相关(P<0.05)。结论①封闭群小鼠背侧海马Munc18-1含量可出现年龄相关性显著升高,其中以雌鼠升高更明显;②封闭群小鼠可出现年龄相关性血清甲状腺激素水平显著降低,其中以雌鼠降低更明显;③血清甲状腺激素水平降低可能是导致背侧海马Munc18-1含量升高的原因之一。

突触囊泡融合蛋白Munc18-1在小鼠耳蜗内毛细胞的定位表达

目的研究突触囊泡融合蛋白Munc18-1在小鼠耳蜗内毛细胞的表达及定位。方法应用激光共聚焦成像技术,通过免疫荧光单标法检测Munc18-1蛋白在小鼠耳蜗内毛细胞中的表达,免疫荧光双标法检测其与带状突触蛋白Ct BP2的定位关系。结果通过激光共聚焦成像技术检测发现,免疫荧光单标染色显示内毛细胞胞质中有高浓度的Munc18-1蛋白表达,免疫荧光双标染色结果显示Munc18-1蛋白聚集在Ct BP2蛋白附近。结论 Munc18-1蛋白在耳蜗内毛细胞中有表达,聚集在突触蛋白Ct BP2周围,可能与维持突触囊泡融合、胞吐功能紧密相关。

参与膜泡运输的蛋白家族及其运行机制的研究进展

细胞的生长和分化最终体现在蛋白质的差异上 ,蛋白质在胞浆中的核糖体合成后 ,便被运送到特定的细胞器、细胞膜或者分泌到细胞外。细胞在其生长、发育、衰老、死亡等过程中 ,都伴随着特定蛋白的定位及运输。膜泡运输对于完成细胞器及细胞膜之间的蛋白运输功能至关重要 ,目前已发现了参与这一过程的 4个蛋白家族 ,并对其基本的运行机制有了一定的了解。

Syntaxin-1蛋白的多重功能(英文)

Syntaxin-1是特异性地分布在神经细胞突触前质膜上的蛋白。它早期被作为分子量为35 kD的synaptotagmin-1结合蛋白,但很快就被认识到是细胞质膜融合的关键蛋白。Syntaxin-1通过与SNAP25和Synaptobrevin/VAMP蛋白聚合,进而形成被认为是神经突触囊泡融合必要因子的SNARE核心复合体。作为一个多结构域的蛋白,syntaxin-1与多个突触蛋白相互作用,其作用远超出了仅作为SNARE核心复合体中一个蛋白质成员的作用。本文着重介绍了有关syntaxin-1与其它SNARE组份蛋白、munc18蛋白和钙离子通道的相互作用及其功能的最新研究进展。全面揭示syntaxin-1作为SNARE核心复合体成员的功能以及超越这一功能的作用,还有待于对其结构以及与其它突触蛋白相互作用特性的进一步深刻理解。

谷氨酸促进大脑皮层神经元Munc18的释放和细胞表面的分布(英文)

目的Munc18被普遍认为存在于神经元细胞内,参与神经递质的释放。虽然已有研究表明在Rasmussen’s脑炎病人中有Munc18自身抗体的产生,但对于Munc18的自身免疫机制目前还不清楚。本研究旨在观察Munc18是否可由神经元释放及是否部分分布于神经元细胞表面,并对Munc18抗体是否能诱导神经元损伤进行研究。方法分离胎龄17天Sprague-Dawley胎鼠大脑皮层神经元,用Neurobasal培养基培养。培养液中的蛋白经三氯乙酸沉淀后进行免疫印迹检测,细胞表面蛋白则用EZ-Link-sulfo-NHS-LC-Biotin进行生物素标记,细胞裂解后用结合有亲和素的琼脂糖珠获取生物素标记的蛋白,随后进行免疫印迹检测。在4°C进行活细胞免疫荧光染色,观察神经元细胞表面Munc18的分布。用乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)释放指标检测神经元损伤。结果用免疫印迹法可在神经元培养的条件培养液中检测到Munc18蛋白。用谷氨酸(50μmol/L)处理神经元1 h后,培养液中Munc18含量显著增加,同时培养液中未检测到β-actin和syntaxin1,LDH释放也未明显增加。此外,谷氨酸处理能增强神经元表面的Munc18分布。活细胞免疫荧光染色检测到在谷氨酸处理后,神经元表面分布有Munc18,主要位于神经突起与另一神经元接触的部位以及不同神经元的神经末梢交汇部位。谷氨酸诱导的神经元表面Munc18分布增加可被NMDA受体拮抗剂MK801抑制,而AMPA受体拮抗剂未有明显的抑制作用。LDH检测显示,在培养液含有血清成份的情况下,与对照的c-Fos抗体相比,Munc18抗体可明显诱导神经元损伤。结论一部分Munc18可由神经元释出或在神经细胞表面分布。谷氨酸可通过兴奋NMDA受体促进Munc18的释放和在神经细胞表面的分布。并且,Munc18抗体诱导的神经元损伤依赖于血清中的因子。

神经元兴奋性毒性对Munc18-1蛋白在大鼠海马神经元和原代培养神经元胞核内分布的影响(英文)

目的 Munc18-1在中枢神经系统递质释放过程中具有重要作用,控制着突触囊泡释放步骤的每一个环节。Munc18-1功能异常与癫痫发病相关。本文主要探讨癫痫是否会引起神经元胞核内Munc18-1定位的改变。方法通过海马内注射海人藻酸建立Sprague-Dawley(SD)大鼠癫痫模型,腹腔注射海人藻酸建立昆明小鼠癫痫模型。分离胎龄18天SD大鼠海马神经元,用Neurobasal培养基培养7天后,用谷氨酸处理3h。用蔗糖密度梯度离心法分离神经元和神经胶质细胞的细胞核组份,通过甲酚紫染色对上述富含细胞核的组份进行形态学鉴别。用免疫组化和免疫电镜分析法确定Munc18-1的细胞核定位。免疫印迹法检测不同细胞组分的Munc18-1蛋白的表达水平。结果免疫组化、免疫电镜以及对神经元细胞核组份的免疫印迹证实了Munc18-1在海马神经元细胞核的分布定位。在海人藻酸诱导癫痫的动物海马内,免疫组化染色显示Munc18-1在海马CA区锥体细胞层、齿状回颗粒细胞层和门区的多型细胞表达减少。同时,免疫印迹分析表明,Munc18-1在海马神经元胞核中的表达水平明显下降。免疫印迹检测显示,原代培养神经元经50μmol/L谷氨酸处理3h后,Munc18-1在神经元胞核中的分布减少,而胞浆组份中含量增加。免疫荧光的形态学检测也显示部分神经元明显失去了Munc18-1在细胞核聚集分布的特征。结论兴奋性刺激能够使Munc18-1在神经元的表达分布发生改变,这种变化可能参与调节脑神经元的功能。