Myf6基因在不同地方鸡种早期生长发育中的表达分析

为了探究Myf6基因在京海黄鸡和金茅黄鸡体内的差异表达规律,研究其在两个品种鸡中可能发挥的作用机制,试验采用实时荧光定量PCR技术对Myf6基因在不同品种鸡不同组织中的表达情况进行了检测。结果表明:京海黄鸡和金茅黄鸡公母鸡胸肌和腿肌中的Myf6基因相对表达量均比较高,且极显著高于脾脏(P<0.01);京海黄鸡心脏组织中的Myf6基因相对表达量显著高于脾脏(P<0.05),金茅黄鸡心脏组织中的相对表达量极显著高于脾脏(P<0.01);两个品种鸡的其余组织中Myf6基因相对表达量与脾脏相比差异不显著(P>0.05)。京海黄鸡公母鸡胸肌和腿肌组织中Myf6基因的表达规律基本一致,仅在4周龄胸肌组织中有稍微下降的趋势,但总体上呈现上升的趋势;腿肌组织中的相对表达量比较稳定,从0周龄到16周龄呈现上升趋势,16周龄时达到最高水平。金茅花鸡公母鸡胸肌和腿肌组织中Myf6基因的相对表达量从0周龄到4周龄呈上升趋势,8周龄有稍微下降的趋势,之后又呈现上升的趋势。在两个品种中,无论是公鸡还是母鸡,胸肌中Myf6基因的相对表达量始终显著高于腿肌(P<0.05)。说明Myf6基因参与了肌肉的生长发育,并且发挥了不可替代的作用。

牛myf6基因真核表达载体的构建及在成肌细胞中的表达

【目的】构建牛myf6基因真核表达载体,并观察myf6真核表达载体转染鲁西黄牛成肌细胞后基因的表达和细胞形态的变化。【方法】在质粒pIRES2-EGFP的多克隆位点插入myf6基因构建真核表达载体pIRES2-EGFP-myf6,用脂质体技术转染鲁西黄牛成肌细胞,通过G418筛选出稳定转染的细胞株。利用Western印记、Real-time PCR技术检测成肌细胞转染前后myf6基因、肌肉肌酸激酶基因和肌球蛋白轻链基因的表达量。【结果】与对照组相比,转染质粒的成肌细胞myf6蛋白和mRNA的表达量提高(P<0.01),肌肉肌酸激酶基因和肌球蛋白轻链基因的mRNA表达量提高(P<0.01)。细胞形态观察显示成肌细胞融合为肌管。【结论】构建的真核表达载体pIRES2-EGFP-myf6能在成肌细胞中高效表达,myf6基因促进了成肌细胞向肌肉细胞分化。

牛myf6基因克隆及在成纤维细胞中的表达

克隆了牛的myf6基因并构建真核表达载体pIRES2-EGFP-myf6,用脂质体技术转染鲁西黄牛成纤维细胞,通过G418筛选出稳定转染的细胞株,利用Western印记、Real-time PCR技术检测myf6对成纤维细胞的影响。结果表明,与对照组相比,稳定转染后的成纤维细胞myf6蛋白和mRNA的表达量提高(P<0.01),肌肉肌酸激酶基因mRNA表达量升高(P<0.05),肌球蛋白轻链基因的mRNA表达量也提高(P<0.01)。细胞形态观察显示转染后的成纤维细胞未融合为肌管。由此可知,牛myf6基因可以在成纤维细胞中表达并且有促进成纤维细胞向肌肉细胞分化的功能。

鸡Myf6基因遗传多态性及其遗传效应研究

采用测序和单链构象多态(SSCP)的方法分析了Myf6基因在5个优质肉鸡纯系和3个杂交配套系中的遗传分布、遗传变异及群体杂合性等群体遗传信息,并分析了Myf6基因对胴体性状及肉质性状的遗传效应。结果发现该基因的CDS区域非常保守,仅在外显子1的47位处发生点突变由G→A,由于人工选育的原因,该基因不同基因型的分布在2个优质肉鸡纯系中偏离了Hardy-Weinberg平衡,并且杂合度较低,遗传一致性较高,但在3个杂交配套系中仍都服从Hardy-Weinberg平衡,杂合度较高,达到了配套杂交的目的。野生型A基因可显著地提高活重、屠体重、胸肌重和腿肌重(P<0.05),同时也会降低肉的嫩度。具体地讲,A基因对增加活重、屠体重、胸肌重和腿肌重的加性效应值分别为45.54g,41.03g,6g和9.775g;对增加肌纤维直径和肌纤维密度的加性效应值分别为1.025μm和-29.99mm2。

巴美肉羊、小尾寒羊Myf6基因多态性及其与肉质的相关性研究

实验采用聚合酶链式反应-单链构象多态(PCR-SSCP)方法对102只巴美肉羊、56只小尾寒羊的Myf6基因片段进行多态性检测,分析Myf6基因多态性与肉质的相关性。巴美肉羊和小尾寒羊在Myf6基因片段上共检测到2种基因型AA和AB型,它们的基因型频率分别为0.63、0.37和0.38、0.62;A、B的等位基因频率分别为0.81、0.19和0.69、0.31;多态信息含量分别为0.26和0.34,属中度多态。在巴美肉羊群体中,AA型,AB型的肉质指标无显著差异;在小尾寒羊群体中,小尾寒羊Myf6的AA型与AB型在背最长肌处的红度值存在显著性差异(p<0.05)。

五指山猪不同组织中肌细胞生成素基因Myf4及生肌调节因子Myf6的表达

本文通过运用Real-time PCR技术,检测肌细胞生成素基因Myf4和生肌调节因子Myf6在出生后的第30天、第210天、第360天(出生到体成熟)的五指山猪肌肉组织中的表达变化,以及Myf4、Myf6在体成熟五指山猪肌肉、心、肝、脾、肺、肾、胃、小肠组织中mRNA相对表达情况。结果表明:Myf4及Myf6基因在五指山猪出生后在肌肉组织中的mRNA表达水平随着五指山猪的生长年龄生长而显著增长(p<0.05);Myf4及Myf6基因在成年五指山猪以上8种组织中均有表达,其中在肌肉组织中相对表达量最高。本研究结果将为五指山猪肌肉生长发育及矮小性状形成机理提供参考。

鸭胚骨骼肌不同组织Myf6基因表达的发育性变化研究

为研究Myf6基因对鸭肌肉发育的影响,本试验利用实时荧光定量PCR绝对定量技术检测Myf6基因在高邮鸭和金定鸭胚胎期第13、17、21、25、27天及出生后7日龄胸肌、腿肌发育过程中的表达量。结果显示,Myf6基因在2个品种的胸肌和腿肌中均有表达,在不同品种同一肌肉组织中的表达变化规律一致,而在不同肌肉组织中的表达模式不同,其中在胸肌组织中21胚龄时表达量最高,随后表达量下降,维持相对较高表达水平;在腿肌组织中13胚龄时表达量较高,17胚龄时达到最高,随后表达量有所降低,并在21胚龄后急速下降至极低水平,但其表达在胚胎期后期(27胚龄)及初生期(7日龄)又有缓慢上升趋势。上述结果表明,Myf6基因参与了胸、腿肌组织的发育,在胸、腿肌中表达模式不同,推测Myf6基因在胸、腿肌中的调控存在差异,可能与其胸、腿肌不同肌纤维的发育与分化有关。

Myf5、Myf6基因在黔北麻羊与努黔F1代不同组织表达差异性的研究

实验旨在探究Myf5、Myf6基因在黔北麻羊和努黔F_1代各组织间的相对表达水平。应用实时荧光定量PCR法检测Myf5、Myf6基因在黔北麻羊(3只)和努黔F_1代(3只)的心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、背最长肌、股二头肌和臂三头肌等组织间的相对表达量。结果表明:各组织Myf5、Myf6基因在黔北麻羊和努黔F_1代间表达差异不显著;2种基因在黔北麻羊臂三头肌、股二头肌和背最长肌相对表达量均极显著高于肾脏、肝脏、心脏、脾脏、肺脏(P<0.01),其中Myf5基因在肾脏相对表达量显著高于脾脏和肺脏(P<0.05),Myf6基因在心脏和肝脏相对表达量均显著高于脾脏(P<0.05);2种基因在努黔F_1代臂三头肌、股二头肌和背最长肌相对表达量均极显著高于肝脏、肾脏、心脏、脾脏、肺脏(P<0.01),心脏和肝脏相对表达量均显著高于肺脏(P<0.05)。综上,Myf5、Myf6基因在黔北麻羊和努黔F_1代8种组织中均有表达且表达量不等,在肌肉组织中的表达量最高。

生肌决定因子Myf6基因多态性与畜禽生产性状的关系

论文简介了Myf6基因的结构特征、功能及表达的时效性,综述不同物种Myf6基因的变异特征以及Myf6基因的不同基因型与畜禽生产性状的相关性,以期为提高畜禽的产肉潜力及改善肌肉品质提供辅助标记选择依据。

牦牛Myf6基因克隆及生物信息学分析

本试验旨在克隆牦牛Myf6基因,进行生物信息学分析并探究其在牦牛不同时期的表达情况。以青海雪多牦牛为研究对象,通过设计引物对其Myf6基因CDS区进行克隆测序,运用生物信息学软件对其功能结构进行预测研究。结果显示,牦牛Myf6基因含有一个大小为729 bp的开放阅读框(ORF),编码242个氨基酸。同源性比对和进化树分析结果表明,牦牛Myf6氨基酸序列与普通牛、绵羊亲缘性最近。对Myf6蛋白理化性质进行预测分析得到其结构式为C1167H1870N336O372S13,理论等电点为5.64,其中丝氨酸含量最高,其次是亮氨酸、谷氨酸、脯氨酸和精氨酸;其疏水平均值为-0.586,亲水性最强为-2.467,疏水性最强为1.511,为亲水性、可溶性蛋白;有可形成卷曲螺旋部位;磷酸化位点预测其有26个丝氨酸激酶,10个苏氨酸激酶,5个酪氨酸激酶;亚细胞定位分析其编码产物在细胞核中分布最多(73.9%),其次为细胞骨架(13.0%)、细胞质(4.3%)、高尔基体(4.3%)、分泌系统小泡(4.3%)。蛋白质二级结构主要由无规则卷曲(49.17%)组成,其次是α-螺旋(33.47%)、延伸连(11.57%)及β-折叠(5.79%)。蛋白功能分析显示其生长因子功能几率较大(7.694),其次为转录调节作用,预测其作为一种生长因子参与机体生物学调控。实时荧光定量PCR结果显示,Myf6基因在胎牛、6月龄、4~5岁牦牛背最长肌中均有表达,且在6月龄的表达量显著高于胎牛和4~5岁牦牛(P<0.05)。上述结果为研究牦牛Myf6生肌因子提供了重要的研究数据,为改良牦牛经济性状提供了参考。

miR-374b及其靶基因Myf6调控成肌细胞增殖分化的研究

本实验旨在研究miR-374b及其靶基因Myf6调控肌细胞增殖分化的作用机制。首先采集70日龄胎羊,培养成肌细胞并诱导分化成肌管,通过荧光定量PCR测定诱导分化时期(0、24、72、120 h)miR-374b、Myf6基因以及成肌细胞增殖标志基因MyoD和分化标志基因MyoG、MyHC在mRNA水平的表达量;通过转染miR-374b过表达载体(mimics)及抑制载体(inhibitor),研究各基因在细胞中mRNA水平的表达规律;采用蛋白免疫印迹技术检测Myf6基因在细胞中蛋白水平表达变化规律。结果表明:细胞在分化第72、120小时出现大量肌管,诱导分化成功;miR-374b的表达趋势为先上升后下降,细胞增殖标志基因MyoD在细胞增殖期(0 h)表达量较高;分化标志基因MyHC、MyoG及Myf6基因在细胞增殖期表达量较低,进入分化阶段后表达量极显著上调;转染miR-374b过表达载体(mimics)后,miR-374b表达量极显著高于阴性对照组,而Myf6基因、MyHC基因表达量极显著低于阴性对照组;Myf6基因蛋白表达量极显著低于阴性对照组;转染miR-374b抑制载体(inhibitor)后,miR-374b表达量极显著低于阴性对照组,而Myf6、MyHC、MyoD基因表达量极显著高于阴性对照组;Myf6基因蛋白表达量极显著高于阴性对照组;MyoG基因表达量显著低于阴性对照组。上述结果表明,miR-374b可能通过靶向Myf6基因抑制绵羊成肌细胞分化。

MyoD、Myf6和Mef2c慢病毒过表达载体构建及诱导猪MSC成肌向分化的研究

骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSC)是重要的成体干细胞,具有多向分化的能力,其成肌分化能力在医学上有广泛的应用,可用于多种疾病的治疗。成肌决定因子(MyoD)和成肌调节因子6(Myf6)同属生肌决定因子基因家族,控制着肌细胞的增殖分化,肌细胞增强因子(Mef2c)是一个具有重要功能的转录因子,可以作为心肌分化过程中的特异性标志。本试验通过构建猪MyoD、Myf6和Mef2c慢病毒表达载体,并在体外感染猪间充质干细胞(pMSC),成功在pMSC中过表达MyoD、Myf6和Mef2c三种调节因子,并且诱导MSC表达肌细胞生成素(MyoG)、肌肉特异型肌酸激酶(CKM)等重要的成肌相关因子。本研究为利用慢病毒过表达成肌相关因子诱导MSC细胞向成肌细胞分化奠定基础,为进一步探明MSC向成肌细胞分化的分子机制提供发新思路。

miR-374b与Myf6在绵羊不同生长时期骨骼肌中表达规律的研究

为探讨miR-374b及其靶基因Myf6调控肉羊肌肉生长发育的分子机制,本实验运用qRT-PCR对miR-374b、Myf6在南非肉用美利奴羊4个不同生长时期(胎龄90 d、胎龄120 d、初生期、出生后60 d)背最长肌和股二头肌mRNA水平的表达规律进行研究;对4个不同生长时期的背最长肌及股二头肌进行HE染色,通过Image J软件分析计算得出不同部位的单根肌纤维横截面积,对miR-374b、Myf6的mRNA表达量与单根肌纤维横截面积变化进行相关性Person检验。结果显示:南非肉用美利奴羊4个不同生长时期,背最长肌中miR-374b、Myf6基因mRNA相对表达量总体呈下降趋势;在股二头肌中miR-374b与Myf6 mRNA表达变化趋势相反;背最长肌和股二头肌单根肌纤维横截面积随月龄增加均呈极显著增长,肌纤维横截面积均表现为股二头肌>背最长肌;在背最长肌中miR-374b表达量与单根肌纤维横截面积变化呈极显著负相关(r=-0.941,P<0.01),Myf6表达量与单根肌纤维横截面积变化呈显著负相关(r=-0.625,P<0.05);在股二头肌中miR-374b表达量与单根肌纤维横截面积变化呈显著负相关(r=-0.677,P<0.05),Myf6表达量与单根肌纤维横截面积变化无显著性相关关系。综上推测,miR-374b密切调控动物肌肉生长,对绵羊骨骼肌生长具有一定的抑制作用。

蒙古羊后腿肌肉组织中MYF6和MEF2A基因的甲基化分析

为了分析生肌决定因子(MYF6)和肌细胞增强因子(MEF2A)基因在蒙古羊肌肉组织中的甲基化状态,试验以蒙古羊后腿的8种不同肌肉组织臀中肌、胫骨前肌、股四头肌、趾深屈肌、阔筋膜张肌、腓肠肌、腓骨长肌、半膜肌为材料,采用凝胶电泳技术检验样品DNA的质量,然后用亚硫酸氢盐修饰基因组DNA并对其进行PCR扩增,通过甲基化分析软件对PCR扩增产物的测序结果进行分析以评价各肌肉组织中MYF6和MEF2A基因的甲基化模式。结果表明:不同肌肉组织中MYF6基因均未发生甲基化,而MEF2A基因均发生DNA甲基化,甲基化率均达到100%。说明MYF6和MEF2A基因的甲基化模式在不同肌肉组织之间具有一致性,且根据MYF6基因全部未甲基化、MEF2A基因完全甲基化的结果推测MYF6和MEF2A基因的甲基化并不会对蒙古羊肌肉的形成和分化产生显著影响。

努比亚山羊Myf6基因的克隆及组织表达研究

研究旨在克隆努比亚山羊生肌因子6(Myf6)基因,并对其进行生物信息学分析,检测Myf6基因在努比亚山羊不同组织的表达差异以及努比亚山羊和隆林山羊背最长肌组织的表达差异。以努比亚山羊背最长肌组织cDNA为模板,PCR扩增获得Myf6基因的完整编码区(CDS)后进行菌液验证,并进行序列相似性比对以及系统进化树构建;分析Myf6蛋白理化性质并预测其亲/疏水性,预测蛋白二级结构和三级结构。采用实时荧光定量PCR检测Myf6基因在努比亚山羊心脏、肝脏、脾脏、肾脏、背最长肌、皮下脂肪、瘤胃以及隆林山羊背最长肌中的表达。结果显示,努比亚山羊Myf6基因CDS序列长729 bp,编码242个氨基酸。努比亚山羊Myf6氨基酸序列与绵羊、黄牛、猪、驴、人、小鼠的相似性分别为99.3%、98.8%、94.1%、93.8%、93.4%和89.0%。蛋白理化性质分析结果表明,山羊Myf6蛋白的分子质量为26.98 ku,为不稳定酸性蛋白;亲疏水性分析发现,该蛋白为亲水蛋白;跨膜结构和信号肽预测结果发现,该蛋白不含有跨膜结构和信号肽,不属于跨膜蛋白和分泌蛋白;二级结构预测结果显示,该蛋白主要由无规则卷曲(49.59%)构成,其次为α-螺旋(33.88%)、延伸链(9.50%)和β-转角(7.02%),三级结构预测结果与二级结构一致。实时荧光定量PCR结果显示,Myf6基因在努比亚山羊背最长肌的表达量最高,显著高于其他组织(P<0.05),在肾脏的表达量最低,但与心脏、肝脏、脾脏、皮下脂肪、瘤胃等差异均不显著(P>0.05);对比努比亚山羊和隆林山羊背最长肌的Myf6基因的表达情况发现,努比亚山羊的表达量显著高于隆林山羊(P<0.05)。试验为进一步揭示Myf6基因在肌肉分化中的作用提供了参考。

绵羊MYF6基因多态性对胴体瘦肉性状的影响

【目的】研究绵羊生肌因子6(myogenic factor 6,MYF6)基因的多态性,分析其对羔羊胴体瘦肉性状的影响。【方法】以215只新西兰罗姆尼公羔为对象,采集其血样,屠宰后测定其后腿、腰部和肩部瘦肉量等胴体指标。提取血样基因组DNA,采用PCR-SSCP检测MYF6基因5′UTR和第1外显子2个区域的多态性,分析核苷酸序列变异对羔羊胴体瘦肉性状的影响。采集绵羊乳腺、肝脏、心脏、背最长肌、脾脏、肺脏、卵巢和肾脏组织,以β-actin为内参基因,用RT-qPCR等方法检测MYF6基因的相对表达量。【结果】在第1外显子区域,检测到1个SNP(c.129 C>T),有A和B 2种等位基因,存在AA和AB 2种基因型。在5′UTR区域检测到1个3 bp的碱基缺失(c.-589~-590 del ATA),有C和D 2种等位基因,存在CC和DD 2种基因型。2个区域的基因型分布均处于Hardy-Weinberg平衡状态。MYF6基因第1外显子的基因型极显著影响了羔羊后腿、腰部和肩部3个部位的瘦肉量,以及总瘦肉量和腰部瘦肉比例(P<0.01)。MYF6基因在绵羊乳腺、肝脏、心脏等8个组织中均有表达,但以背最长肌中的表达量最高(P<0.05)。【结论】绵羊MYF6基因具有丰富的多态性,其基因型对胴体瘦肉性状有显著影响。

鸭发育早期骨骼肌中Myf6基因表达的发育性变化研究

为研究生肌调节因子Myf6基因对鸭胚胎期以及初生期肌肉组织发育的影响,本研究利用实时荧光PCR绝对定量技术检测了Myf6基因在生长速度不同的高邮鸭和金定鸭胚胎期第13、17、21、25、27天及初生期7日龄胸肌、腿肌发育过程中的表达量。结果表明:Myf6基因在两个品种的胸肌和腿肌中均有表达,在不同品种相同组织的表达变化规律一致。

利用CRISPRi干扰研究MyoG和Myf6基因对牛骨骼肌卫星细胞分化的影响

CRISPR干扰(clustered regularly interspaced short palindromic repeat interference,CRISPRi)技术因高效的基因干扰效率而成为基因功能研究的重要工具。Myo G、Myf6基因是生肌调节因子家族(myogenic regulatory factors,MRFs)的重要成员,是骨骼肌分化所必需的调控因子。该研究以牛骨骼肌卫星细胞为实验材料,探讨Myo G和Myf6基因在骨骼肌卫星细胞分化过程中的相互关系。构建Myo G、Myf6基因CRISPRi载体,分别转染牛骨骼肌卫星细胞,诱导其分化,Real-time PCR检测肌肉分化重要功能基因Myo G、Myf6、MYH2、Myo D的表达情况。结果表明,在牛骨骼肌卫星细胞分化期间,抑制Myo G基因表达将诱导Myf6基因的代偿性升高,但并不能完全弥补Myo G基因的缺少对肌肉分化产生的影响,而抑制Myf6基因表达则不会引起Myo G基因表达升高,这为肌肉分化机制的阐明提供了理论依据。

慢病毒介导的MyoD,Mef2c和Myf6诱导猪骨髓间充质干细胞(pMSC)向成肌样细胞分化的研究

慢病毒是一种以人类免疫缺陷I型病毒为基础发展起来的逆转录病毒,能够在细胞中长期稳定的表达或者沉默特定的基因,是一种高效的基因治疗载体。慢病毒源于反转录病毒,但在感染能力方面比反转录病毒强,对神经元细胞、肝细胞、干细胞、肿瘤细胞、心肌细胞等多种传统方法难以转染的细胞均有较强的感染能力,因此具有广阔的应用前景。同时。

高邮鸭和金定鸭发育早期骨骼肌MyoG和Myf 6基因的表达分析

【目的】研究生肌调节因子肌细胞生成素(MyoG)和生肌决定因子(Myf 6)基因表达对鸭胚胎期及初生早期骨骼肌发育的影响。【方法】采用Real-time PCR方法研究MyoG、Myf6基因在不同鸭品种(高邮鸭和金定鸭)胚胎期(13,17,21,25,27胚龄)及初生早期(出雏后7日龄)骨骼肌发育中的表达差异,并分析其表达变化与胸、腿肌发育的相关性。【结果】MyoG和Myf6基因在2个品种鸭胸肌、腿肌组织发育早期均有表达,但不同组织存在不同的表达模式。MyoG在鸭胚胸肌、腿肌组织中均呈现"前高后低"的表达模式,21胚龄以前表达量相对较高,随后表达量下降,并维持相对较低水平;而Myf6基因在胸肌组织中在21胚龄时表达量最高,随后表达量下降,但仍维持相对较高的表达水平;在腿肌组织中在13胚龄时表达量较高,在17胚龄时达到最高,随后表达量有所降低,并在21胚龄后急速下降至极低水平,但其表达在胚胎期后期(27胚龄)以及初生期(7日龄)又有缓慢上升趋势。二元变量相关性分析结果表明,2个品种鸭胸肌、腿肌MyoG mRNA表达与胸肌、腿肌发育呈强负相关;胸肌中Myf6mRNA的表达与胸肌发育无显著相关性,腿肌中Myf6mRNA的表达与腿肌发育呈强负相关。【结论】骨骼肌中MyoG和Myf6基因表达具有显著的时空性,性别差异不显著,骨骼肌中MyoG和Myf6基因表达与鸭发育早期骨骼肌质量变化呈现负的线性相关。