RNA干扰技术抑制人内皮细胞非肌肉肌球蛋白重链ⅡA(MYH9)表达的研究

目的:构建人MYH9(非肌肉肌球蛋白重链ⅡA)的siRNA表达体系,抑制原代人脐静脉内皮细胞(HUVEC)MYH9基因的表达。方法:针对人MYH9基因序列,构建siRNA表达质粒,通过酶切和测序鉴定确定其序列正确性。分别转染重组质粒pGCsi-MYH9-1/2/3至HUVEC细胞,通过半定量RT-PCR和蛋白质印迹,分别检测在转染后24h、48h、72h MYH9在mRNA转录水平及蛋白表达的变化。结果:在构建的3种重组质粒中,pGCsi-MYH9-2、pGCsi-MYH9-3在转染后24h均表现出一定的干扰作用,转染后48h干扰作用最强,转染后72h干扰作用减弱;pGCsi-MYH9-3的干扰作用最明显,转染后48h,能明显下调HUVEC的MYH9蛋白表达,抑制率平均可达71.2%,此时MYH9基因mRNA转录明显减少,抑制率为86.5%。结论:在转染后48h pGCsi-MYH9-3可明显抑制HUVEC细胞内源MYH9的表达,为进一步研究MYH9在相关疾病中的功能奠定基础。

我国部分汉族人群MYH9多态性与终末期肾病的关联研究

目的:探索我国部分汉族人群非肌性肌球蛋白9(MYH9)基因第22号外显子与24号外显子间基因序列多态性与终末期肾病(ESRD)的关系。方法:采用以医院为基础的病例对照研究设计,纳入180例ESRD患者,并选择同期体检118例作为对照人群。采用PCR后测序策略检测MYH-9基因多态性,运用Phase2.0软件计算多态性位点连锁关系,转录因子结合位点分析采用网络AliBaba2软件完成。结果:采用双向测序共发现8个基因片段多态性位点,其中5个为新发多态性位点,3个为以前报道的多态性位点。新发多态性位点中,有2个多态性位点(G489A和A616C)位于MYH9基因第23内含子中。关联研究发现,G489A仅存在于ESRD患者中,与对照组比较有显著差别(P=0.013),该结果提示该基因转换可能是危险因素。以前文献报道的Rs4821480(MYH9-92)、Rs2032487(MYH9-273)及Rs4821481(MYH9-787)未见与ESRD相关。连锁分析结果显示TCTCGGAT为最常见连锁形式,但ESRD人群该连锁基因型频率稍低于对照组,而TCTCGGCT和TCTCAGAT在ESRD人群出现频率较对照人群高。转录因子结合位点分析,MYH9基因第23内含子的野生型转录因子结合位点数量少于基因突变后的数量。结论:我国汉族人群MYH9基因23内含子附近基因序列的多态性及其连锁关系可能与ESRD发生、进展相关,该基因可能通过基因突变造成该区域转录因子结合位点数量改变来影响疾病的进程。

非肌球蛋白重链9相关疾病大家系患者中性粒细胞包含体特点分析

目的分析一非肌球蛋白重链9相关疾病(MYH9-RD)大家系患者中性粒细胞包涵体的形态和结构特点,阐明MYH9-RD中性粒细胞包涵体形成的特点,以探讨MYH9-RD中性粒细胞包涵体的致病机制。方法应用光学显微镜(瑞姬染色)和电子显微镜观察中性粒细胞包涵体形态和超微结构特点;应用间接免疫荧光复染技术观察MYH9-RD患者与正常对照者之间非肌性肌球蛋白IIA(NMMHC-IIA)在胞浆中的分布情况。结果光学显微镜和电子显微镜下可见中性粒细胞中明显的包涵体,形态多样,大多位于细胞边缘;间接免疫荧光复染技术显示患者和正常人之间NMMHC-IIA在中性粒细胞中的分布有差异,中性粒细胞胞浆中存在明显绿色荧光的包涵体,其形态和轮廓与瑞一姬氏染色显示的包涵体形状、大小基本一致,但更为清晰;正常对照的粒细胞胞浆中未见包涵体。结论光学显微镜和电子显微镜进一步确认了家系患者包涵体的存在。免疫荧光技术显示患者和正常人之间NMMHC-IIA在中性粒细胞中的分布有差异;MYH9-RD患者中性粒细胞包涵体的主要构成成份是NMMHC-IIA;包涵体的形态结构复杂多样可能与本家系临床表型复杂多样有关,该家系对进一步揭示MYH9-RD的致病机制具有重要的意义。

ubiquilin 4相互作用蛋白的鉴定

目的筛选、鉴定与ubiquilin 4相互作用的蛋白,探讨ubiquilin 4在肿瘤发生、发展中的作用机制。方法利用细胞免疫荧光技术,确定外源及内源ubiquilin 4在MKN45细胞中的定位;构建含有UBQLN4和GST标签的原核表达载体p GEX-UBQLN4,将其转化至大肠杆菌中,6 h后收集蛋白。运用标签纯化ubiquilin 4,利用GST-pull down技术寻找差异条带,再进一步应用蛋白质谱技术鉴定蛋白,并通过免疫共沉淀法进行验证。结果免疫荧光显微镜显示,外源及内源ubiquilin 4均主要定位于细胞核和细胞质。通过纯化及蛋白质谱分析技术鉴定发现,MYH9蛋白与ubiquilin 4存在相互作用。结论 MYH9蛋白与ubiquilin 4存在相互作用,可能为阐明ubiquilin 4在肿瘤发生、发展中的作用机制提供重要的依据。

MYH9基因多态性与肾脏疾病关系研究进展

非肌性肌球蛋白重链9基因,编码非肌性肌球蛋白重链ⅡA,既往研究其与May-Hegglin异常(May-Hegglin anomaly,MHA)、Fechtner综合征(Fechtner syndrome,FTNS)、Sebastian综合征(Sebastian syndrome,SBS)、Epstein综合征(Epstein syndrome,EPS)和Alport样综合征相关。2008年首次用混合连锁不平衡绘图(MALD)方法证实其与非糖尿病终末期肾病及局灶节段性肾小球硬化症相关,后陆续有该基因与高血压肾病、C1q肾病等的相关报道。本文综合国外该基因与肾脏病的相关研究,对其与肾脏病的关系研究进展做一概括,对今后的研究起一定的帮助作用。