鹅MYL1基因的克隆及胚胎期表达特征分析

肌球蛋白是肌纤维的主要组成成分,在肌肉生长和收缩过程中具有重要作用.本研究以鹅(Anser anser)肌肉总RNA为模板,采用RACE的方法,克隆肌球蛋白轻链1(MYL1)基因全长cDNA序列,并进行生物信息学分析.运用实时荧光定量PCR检测MYL1基因在鹅胚胎期的表达特征.结果表明,鹅MYL1基因全长cDNA为1542 bp,编码193个氨基酸残基的肽链.预测鹅MYL1蛋白等电点5.12,分子量21.75 KD,具有典型的EFh和FRQ1结构域,且不同物种间EFh氨基酸序列高度同源.荧光定量PCR结果显示鹅胚胎期MYL1基因mRNA表达量总体呈现上升后下降的趋势,该基因在胚胎期E7就有表达,E7以后表达量逐渐上升,在E18表达量达到高峰后下降.研究结果首次提供了鹅肌肉组织主要结构基因MYL1的全序列和蛋白特征信息,并揭示该基因在鹅肌肉组织发生和发育的功能.

小尾寒羊MYL1基因启动子区的克隆、分析及蛋白表达

为研究绵羊肌球蛋白轻链1(Myosin Light Chain 1,MYL1)基因在骨骼肌中的表达调控和功能,本实验选择3只11月龄小尾寒羊,对其启动子区域进行了克隆和序列特征分析;利用Western blotting法对其编码蛋白在小尾寒羊不同组织(肝、胃、心、肺、背最长肌、脾、卵巢)中的表达进行比较分析。结果表明:MYL1基因含有多个启动子,其最佳启动子可能位于2102~2152 bp处,并且可结合有AP-2、TFIID等多种转录因子;其编码蛋白的分子量约21 ku;该蛋白只在小尾寒羊骨骼肌中表达,在其他组织中均不表达。本研究认为MYL1基因具有多个启动子,虽然其转录后存在多个可变剪接体,但翻译蛋白只有1种,属于绵羊骨骼肌组织特异性表达的基因。

猪Myl1基因启动子克隆及多态性研究

肌球蛋白轻链1基因(Myl1)编码的不同剪切体(主要是MLC1f和MLC3f)与哺乳动物骨骼肌肌纤维类型相关。通过猪BAC文库筛选及引物步行法测序获得Myl1基因的启动子序列,采用PCR-RFLP技术分析蓝塘猪、大花白猪、大白猪、长白猪和杜洛克猪5个品种Myl1基因启动子区的多态性。结果表明,Myl1基因-678C/T位点在蓝塘和大花白等本地猪种中多态性丰富,而在杜洛克、长白和大白等外来猪种中几乎只有CC基因型。

MYL1基因mRNA选择性剪切体的鉴定及其在不同发育时期的蓝塘与长白猪骨骼肌中的表达

肌球蛋白轻链1基因(MYL1)的2个剪切体MLC1f及MLC3f在骨骼肌不同发育时期中发挥着重要作用。为进一步了解MYL1基因在猪骨骼肌发育过程中的重要作用,通过电子克隆、RT-PCR扩增及实时定量PCR方法克隆和鉴定了猪MYL1基因mRNA 5个选择性剪切体(MLC1f、MLC3f、MLC5f-A、MLC5f-B和MLC5f-C)。其中MLC5f-A、MLC5f-B和MLC5f-C是在猪背最长肌中鉴定到的MYL1基因的3个新转录本,目前在人、鼠等其它物种尚无这三种转录本的报道。结果表明,剪切体MLC3f在180日龄长白猪中的表达量最高,而剪切体MLC1f则是在90日龄蓝塘猪的表达量最高;剪切体MLC5f-A在蓝塘与长白猪中各发育时期的表达量都很低;除了剪切体MLC1f外,其余转录本的表达量均为随个体体重的增加而逐步增加。通过对MYL1基因不同选择性剪切体的鉴定,为其在骨骼肌不同发育阶段或组织类型特异性表达调控研究奠定了基础,为该基因功能的研究提供重要线索。

藏猪MYL1基因的克隆及生物信息学分析

为了克隆藏猪肌球蛋白轻链1 (myosin light chain 1, MYL1)基因编码区序列,并对其进行生物信息学分析,试验根据NCBI网站GenBank中公布的野猪MYL1基因mRNA序列(登录号为NM;14374.2)设计特异性引物,以提取的藏猪背最长肌组织总RNA反转录得到的cDNA为模板,对藏猪MYL1基因编码区序列进行PCR扩增,将目的基因进行测序,应用生物信息学分析软件对藏猪MYL1基因编码区序列的同源性、蛋白质的结构和功能(氨基酸组成、一般理化性质、疏水性、二级结构及三级结构、磷酸化位点、跨膜螺旋结构和信号肽亚细胞定位及蛋白网络互作)进行分析。结果表明:藏猪MYL1基因编码区序列全长为453 bp;藏猪与野猪的亲缘关系最近,与斑马鱼的亲缘关系最远;藏猪MYL1基因编码区序列与野猪、牛、智人、马、绵羊、犬、穴兔、家鼠、鸡和斑马鱼的核苷酸序列相似性分别为100%、92.1%、91.4%、91.2%、91.2%、90.5%、90.3%、89.2%、80.6%和68.2%;藏猪MYL1蛋白存在19种氨基酸,由150个氨基酸组成;藏猪MYL1蛋白分子质量为16 657.86 u,分子式为C;H;N;O;S;,脂肪系数为79.33,理论等电点pI为4.63,不稳定系数为37.81,负电荷氨基酸残基(Asp+Glu)总数为26个,正电荷氨基酸残基(Arg+Lys)总数为15个,理论半衰期为30 h,为亲水蛋白;二级结构中α螺旋占比最大(58.67%),其次为无规则卷曲(24.67%),β转角(8.67%)和延伸链(8.00%)占比较小;三级结构与二级结构预测结果相符合;氨基酸序列中共有16个磷酸化位点,其中有8个丝氨酸磷酸化位点,6个苏氨酸磷酸化位点,2个酪氨酸磷酸化位点;无跨膜螺旋结构,为非跨膜蛋白;无信号肽,为非分泌蛋白;主要定位于细胞质(47.8%)中,在细胞核约占26.1%,在细胞骨架约占8.3%,在内质网、高尔基体、分泌系统的囊泡、液泡中均约占4.3%;与TNNC2蛋白及MYH1、MYH3、MYH7等蛋白之间存在互作网络关系,与TNNC2蛋白相关系数高达0.999,与肌球蛋白重链家族MYH1、MYH3和MYH7蛋白相关系数分别为0.979,0.975和0.971,与MYBPC1和TPM1蛋白相关系数均为0.969,与TPM2和TNNI3蛋白相关系数均为0.965。说明藏猪MYL1基因可能具有较强大的生物学功能。

猪MYL1和MYL2基因的mRNA在不同组织中的表达分析

为研究MYL1、MYL2基因在猪的不同组织中的mRNA的表达水平。本试验以大白猪为实验动物,首先,提取其心脏、肝脏、背最长肌、脂肪等组织的总RNA;其次,扩增MYL1、MYL2基因的cDNA序列;最后,以GAPDH基因作为内参,应用实时荧光定量PCR技术检测MYL1、MYL2基因在不同组织中mRNA的表达水平。结果表明:MYL1基因在背最长肌中表达量最高,MYL2基因在心肌和背最长肌表达量最高,在其它器官表达量很少甚至几乎不表达,说明MYL2基因可能对骨骼肌生长和发育起调节作用。本研究表明MYL1和MYL2基因的mRNA在同一猪种不同组织器官间表达量呈现显著性差异,可能与不同组织器官的功能相适应,可为进一步研究猪的肌肉生长发育机理提供理论基础。

藏猪和大约克猪MYL1基因多态性及差异表达分析

为研究猪不同品种的MYL1基因的多态性及mRNA表达差异。本试验以藏猪和大约克猪作为实验动物,采用一代测序技术对藏猪(59头)和大约克猪(58头)MYL1基因起始密码子上游3 kb区域进行多态性检测;利用实时荧光定量PCR技术检测MYL1基因在背最长肌、背脂、肝脏组织差异表达情况。结果表明:藏猪和大约克猪在起始密码子上游3 kb区域发现T-159A突变位点并呈极显著差异(P<0.01);MYL1基因在背最长肌表达量最高,其次是背脂,肝脏的最低,在背最长肌中藏猪MYL1基因表达量极显著高于大约克猪(P<0.01),在背脂和肝脏组织中,藏猪MYL1基因表达量显著高于大约克猪(P<0.05)。推测T-159A位点可能是参与肌肉生长发育的重要调控位点。本研究为下一步开展MYL1基因对猪生长性能及其肉品质的影响提供参考依据。

黄腐酸对小尾寒羊生长及肌球蛋白轻链1基因表达的影响

为了探究黄腐酸(FA)在绵羊上的应用效果,试验以育肥期小尾寒羊为试验动物,在基础日粮中添加不同比例的FA,测定了小尾寒羊的平均日增重、免疫功能指标、血常规指标,并对肌球蛋白轻链1基因(Myl1)的差异表达进行了分析,探究了FA在绵羊日粮中的最适添加量。结果表明:随着FA添加量的增加,小尾寒羊的平均日增重、血清中免疫球蛋白M(IgM)的含量、肌肉中Myl1基因的表达量均逐渐上升,并在添加量为8 g/kg时达到最高,添加FA后血液常规指标无明显变化。说明小尾寒羊基础日粮中FA的最佳添加量为8 g/kg。