组蛋白H2A去泛素化酶MYSM1缺陷小鼠造血干细胞增殖加快且凋亡增加

目的研究组蛋白H2A去泛素化酶MYSM1缺陷(MYSM1-/-)小鼠骨髓造血干细胞(HSC)的静息状态、增殖与凋亡情况。方法分离MYSM1-/-小鼠和野生对照(MYSM1+/+)小鼠的骨髓细胞,利用免疫磁珠和流式细胞仪分选获得表面标志为lin-Sca-1+c-kit+的HSC。采用腹腔注射溴脱氧尿嘧啶核苷(Brd U)的方法检测HSC增殖与细胞周期、采用Hoechst 33342-派若宁(pyronin)Y双染色法检测静息态HSC的比例、采用异硫氰酸荧光素标记膜联素Ⅴ/7-氨基放线菌素D(annexinⅤ-FITC/7-AAD)双染色法检测HSC凋亡。比较MYSM1-/-小鼠和MYSM1+/+对照小鼠HSC数目、细胞周期、细胞增殖和细胞凋亡的变化情况。结果 MYSM1-/-小鼠的骨髓细胞、HSC总数与野生型小鼠相比明显降低;HSC的S期比例增加、增殖加快、静息期细胞减少但功能有缺陷的MYSM1-/-HSC凋亡率显著上升。结论 MYSM1对维持HSC的静息状态有非常重要的作用,其缺陷可引起静息态的HSC大量进入S期,异常增殖的HSC凋亡增加并最终引起HSC和骨髓细胞总数减少。

组蛋白H2A去泛素化酶MYSM1抑制骨髓来源树突状细胞的抗原提呈功能及炎性细胞因子的分泌

目的研究组蛋白H2A去泛素化酶Myb样SWIRM和MPN结构域1(MYSM1)对骨髓来源树突状细胞(BMDC)吞噬、抗原提呈、炎性细胞因子mRNA水平的影响。方法分离小鼠的骨髓细胞,在体外联合粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和白细胞介素4(IL-4)诱导骨髓细胞分化为DC,利用小干涉RNA(siRNA)下调MYSM1的表达,采用免疫荧光微球实验检测BMDC的吞噬功能、流式细胞术检测BMDC的抗原提呈功能、实时定量PCR检测BMDC的IL-6、肿瘤坏死因子α(TNF-α)的mRNA表达变化,探讨MYSM1下调后DC在固有免疫应答中的作用。结果下调MYSM1的表达后,BMDC的吞噬功能无显著变化,抗原提呈功能增强,IL-6、TNF-α的表达增强。结论 MYSM1在固有免疫应答中可以抑制BMDC的抗原提呈功能及炎性细胞因子分泌能力。

小鼠MYSM1基因稳定敲除的间充质干细胞系C3H10T 1/2的建立及其体外免疫调节作用

目的:本研究旨在构建小鼠组蛋白H2A去泛素化酶MYSM1基因敲除的间充质干细胞系(mesenchymal stem cells,MSC),并初步探讨MYSM1基因敲除后MSC免疫学特性的变化。方法:通过CRISPR-Cas9技术对小鼠间充质干细胞系(C3H10T 1/2)MYSM1基因进行特异性基因敲除,再采用流式细胞术、定量PCR和蛋白印迹(Western blot)技术检测基因敲除情况。为检测MYSM1敲除对MSC免疫调节能力的影响,将MYSM1基因敲除的MSC上清加入脾脏淋巴细胞培养体系中,在镜下观察其对淋巴细胞增殖的调节作用,并进一步采用定量PCR检测淋巴细胞内炎性因子白介素4,干扰素γ、白介素17A和Foxp3的表达情况。结果:流式细胞术、定量PCR及Western blot的鉴定结果表明,CRISPR-Cas9技术稳定敲除了MSC细胞系内MYSM1基因。敲除了MYSM1基因之后的MSC上清显著抑制刀豆蛋白A诱导的淋巴细胞增殖及炎性因子分泌(P<0.05)。结论:本研究成功地构建了小鼠MYSM1稳定敲除的间充质干细胞系,同时发现MYSM1敲除后MSC体外免疫抑制作用增强,此相关发现为深入研究MYSM1基因的功能,探索基因修饰MSC对免疫相关性疾病的治疗奠定了基础。

去泛素化酶MYSM1调控人B细胞向浆细胞的分化

目的:探讨去泛素化酶MYSM1对人B细胞向浆细胞分化的调控作用。方法:构建去泛素化酶MYSM1的干扰载体和过表达载体,包装相应慢病毒及对照慢病毒;经人外周血磁珠分选出的CD19^+B细胞;经慢病毒感染48 h后,LPS刺激诱导感染后的CD19^+B细胞向浆细胞分化。流式细胞术检测CD138表达,荧光定量PCR检测B细胞及分化过程中重要转录因子的表达变化。结果:干扰MYSM1表达后,B细胞向浆细胞分化比例显著升高(P<0.01),抑制浆细胞分化的转录因子Pax5和Bach2的表达水平显著下降(P<0.01),而促进浆细胞分化的转录因子Prdm1和Xbp1的表达水平显著升高(P<0.01)。相反,过表达MYSM1后,B细胞向浆细胞分化比例显著下降(P<0.01),抑制浆细胞分化的转录因子Pax5和Bach2的表达水平显著升高(P<0.01),而促进浆细胞分化的转录因子Prdm1和Xbp1的表达水平显著下降(P<0.01)。结论:去泛素化酶MYSM1负调控人B细胞向浆细胞的分化。

去泛素化酶Mysm1通过调控胶质纤维酸性蛋白的表达调节神经干细胞向星形胶质细胞分化

目的研究去泛素化酶Mysm1对神经干细胞(NSC)向星形胶质细胞分化的影响及其作用机制。方法从孕12.5 d C57BL/6胎鼠脑组织中分离NSC在体外进行培养,体外诱导NSC向星形胶质细胞分化。免疫荧光染色、实时定量PCR和蛋白质免疫印迹实验检测体外NSC向星形胶质细胞分化过程中Mysm1表达量的变化;使用慢病毒敲低NSC中Mysm1的表达量并通过实时定量PCR和蛋白质免疫印迹实验检测敲低效率;免疫荧光染色和蛋白质免疫印迹实验比较体外敲低Mysm1前后NSC向星形胶质细胞分化的变化;转录组学检测体外敲低NSC内Mysm1后差异基因情况;蛋白质免疫印迹实验验证差异基因相关蛋白的变化;Cut-Tag检测体外NSC向星形胶质细胞分化过程中Mysm1在胶质纤维酸性蛋白(GFAP)基因启动子区域富集情况;在敲低Mysm1的基础上过表达GFAP,免疫荧光染色和蛋白质免疫印迹实验检测体外过表达GFAP前后NSC向星形胶质细胞分化的变化。结果体外诱导NSC向星形胶质细胞分化时,细胞表达Mysm1逐渐升高;Mysm1敲低会抑制体外NSC向星形胶质细胞分化;Mysm1通过调控GFAP的转录影响NSC向星形胶质细胞分化;在敲低Mysm1的基础上过表达GFAP部分挽救了NSC向星形胶质细胞分化的能力。结论Mysm1通过表观调控GFAP的转录调节NSC向星形胶质细胞分化。

MYSM1全长及截短质粒构建及其对乳腺癌细胞增殖的影响

目的构建去泛素化酶Myb样SWIRM和MPN结构域1(MYSM1)全长及各结构域缺失的截短表达质粒并验证其在乳腺癌细胞MCF7中的表达与定位,探讨MYSM1对MCF7细胞增殖能力的影响并初步评估相关机制。方法以人基因组DNA为模板扩增MYSM1基因片段,构建其全长及截短质粒。将测序结果正确的上述MYSM1质粒分别转染于MCF7细胞中,进行免疫荧光共聚焦实验探究外源MYSM1蛋白在乳腺癌细胞中的定位。MTS和平板克隆实验检测对照或MYSM1过表达后,MCF7细胞的增殖能力。STRING数据库预测及免疫共沉淀实验验证MYSM1与E2F1蛋白结合;Western blot检测转染MYSM1后的E2F1蛋白表达及H2A泛素化水平。结果构建出了FLAG-MYSM1全长及截短质粒;MYSM1全长及截短重组质粒均能在乳腺癌细胞中表达并定位于细胞核;过表达MYSM1后,细胞生长加快,且与对照组相比差异有统计学意义(t=6.389,P<0.01);MYSM1能够结合并上调E2F1表达;过表达MYSM1后,H2A泛素化水平显著降低。结论MYSM1蛋白的168-371 aa及471-576 aa在其核定位中发挥重要作用。MYSM1结合并增加E2F1表达,发挥促进MCF7细胞增殖的作用。

一个MYSM1基因突变致骨髓衰竭综合征4型家系报道附文献复习

目的报道1例MYSM1基因复合杂合变异致骨髓衰竭综合征4型患儿临床表现及全外显子检测结果,同时报道其家系全外显子检测结果,为早期诊断此类骨髓衰竭综合征提供典型案例。方法报道1例1月龄骨髓衰竭综合征4型患儿临床诊断过程,并对患儿及其家系成员外周血DNA进行全外显子测序,使用BWA、GATK等软件对测序结果进行注释分析。结果本例1月龄骨髓衰竭综合征4型患儿,表现为全血细胞减少、多指畸形,影像学示非特异性脑白质改变及囊肿,淋巴细胞亚群分类示CD3-CD19+B细胞降低。通过家系全外显子测序检测,鉴定患儿携带分别遗传自父母的MYSM1基因复合杂合性变异NM001085487.2:c.1607c.1611delAAGAG和c.1432C>T。家系验证证实先证者父亲携带的c.1432C>T突变来源于先证者祖父,先证者母亲携带的c.1607c.1611delAAGAG突变来自于先证者外祖父,其他家系成员均不携带突变。结论本研究新发现MYSM1致病性变异c.1607c.1611delAAGAG,国内外尚未见报道。本例为BMFS4的早期诊断提供了典型案例,并扩展了MYSM1基因致病性变异谱和表型谱。