香蕉果实酵母双杂交文库的构建及后熟转录因子MaMADS2互作蛋白筛选

[目的]本文旨在鉴定香蕉果实后熟关键调控因子MaMADS2的互作蛋白,深入解析MaMADS2影响香蕉果实后熟过程的分子机制。[方法]以MaMADS2为诱饵利用酵母双杂交文库获得候选互作蛋白,通过克隆候选互作基因编码区进行点对点酵母双杂交试验来验证互作情况;利用转录组学分析互作蛋白相关基因在后熟过程中的表达情况;利用双分子荧光互补试验鉴定重要互作蛋白与MaMADS2的互作;最后用蛋白免疫印迹分析MaMADS2蛋白在香蕉后熟过程中的表达。[结果]成功构建了果实在乙烯利催熟下的cDNA文库,初级和次级文库的库容分别为2.9×10^(6)和3.2×10^(6)CFU·mL^(-1),平均插入片段大小在1200 bp以上,可满足后续酵母双杂交筛选的要求。最终共鉴定出7个互作蛋白,其中有2个MADS-box转录因子,3个E3泛素连接酶,2个具有转录抑制作用的蛋白。转录组数据表明,乙烯利可抑制2个MADS-box基因的表达,而1-甲基环丙烯(1-MCP)对其表达起诱导作用。双分子荧光互补试验表明,MaMADS2与MADS-box转录因子Ma04_p30020.1存在互作关系。蛋白免疫印迹分析显示,MaMADS2在后熟过程中蛋白水平逐渐降低,这与其可以和E3泛素连接酶互作是一致的。[结论]通过构建高质量的果实cDNA文库与酵母双杂交筛库技术,鉴定出多个与MaMADS2互作的蛋白,并明确了MaMADS2与另一MADS-box转录因子Ma04_p30020.1之间存在明显的互作关系。