Mage-D1对敲除小鼠骨髓间充质干细胞的矿化调控作用

目的探讨黑色素瘤相关抗原D1(melanoma associated antigen D1,Mage-D1)对小鼠股骨骨量和对大鼠骨髓间充质干细胞(bone mesenchymal stromal cells,BMSCs)矿化能力的影响及潜在分子机制。方法以雌性Mage-D1基因敲除杂合子小鼠和雄性野生型(wide type,WT)小鼠作为亲本小鼠,繁育Mage-D1基因敲除纯合子(Mage-D1 knock out,Mage-D1 KO)小鼠。PCR和琼脂糖凝胶电泳鉴定雄性Mage-D1基因敲除纯合子小鼠和同窝雄性野生型小鼠,micro-CT扫描用于分析小鼠股骨骨量,ELISA和化学法用于检测小鼠血清钙离子、磷离子、降钙素和甲状旁腺素水平。原代培养BMSCs并进行流式细胞术鉴定,免疫荧光染色观察Mage-D1在BMSCs中的表达。构建Mage-D1沉默慢病毒感染BMSCs,分为阴性对照组(sh-NC)和沉默组(sh-Mage-D1);细胞划痕实验检测BMSCs的迁移能力,流式细胞术和CCK-8检测BMSCs周期变化和增殖能力;矿化诱导后行碱性磷酸酶染色、茜素红染色;RT-qPCR和Western blot检测ALP、Runx2、Col1表达水平;RT-qPCR检测矿化相关基因p75NTR及MSX1以探讨潜在机制。结果与野生型小鼠相比,Mage-D1敲除纯合子小鼠股骨皮质骨厚度减小、皮质骨矿物含量降低、松质骨骨矿物含量降低、骨小梁数减少、松质骨骨表面密度降低、骨小梁分离度增大(P<0.05);敲除Mage-D1后,小鼠血钙、血磷、降钙素和甲状旁腺素水平无明显变化。Mage-D1表达于整个BMSCs内,在细胞核及胞核周围区域高表达。与sh-NC相比,sh-Mage-D1组细胞增殖能力降低(P<0.01),细胞迁移能力增强(P<0.01);矿化诱导后,sh-Mage-D1组ALP、Runx2、Col1基因(P<0.05)和蛋白(P<0.01)表达下降,碱性磷酸酶染色和茜素红染色更浅;sh-Mage-D1组细胞中p75NTR、Msx1表达水平比sh-NC组低。结论Mage-D1基因敲除可明显降低小鼠股骨骨量。Mage-D1可促进BMSCs增殖、抑制其迁移,正向调控其体外矿化,p75NTR-Dlx1/Msx1信号轴可能参与Mage-D1对骨代谢活动的调控。

黑色素瘤抗原编码基因家族新成员MAGE-D1的组织表达谱研究

MAGE D1是黑色素瘤抗原编码基因家族 (MAGE)中MAGE D亚家族的新成员 .为了研究该基因的性质及其可能功能 ,采用Northernblot和Dotblot杂交技术研究了其组织表达谱 .结果发现 ,该基因在多种肿瘤组织和正常组织中均广泛表达 .在所检测的 4 8种肿瘤组织中 ,经与对应正常组织进行比较发现 ,该基因在 13种肿瘤组织中的表达显著增高 ,而在 7种肿瘤组织中的表达则显著降低 .进一步分析提示该基因在多种胚胎组织中的表达高于成年组织 .由于MAGE A、 B、 C亚家族均具有在肿瘤组织 睾丸中特异表达的特点 ,而作为MAGE D亚家族成员的MAGE D1并非在肿瘤组织中特异表达 ,提示需要对MAGE基因家族进行深入的功能研究 .

Mage-D1与活化后的p75神经营养因子受体结合可正向调节大鼠外胚间充质干细胞的矿化

目的检测Mage-D1与活化后p75NTR的结合及对外胚间充质干细胞(EMSCs)矿化的调控。方法取孕19.5 d SD大鼠牙胚,组织贴壁法获取EMSCs,流式细胞术检测细胞表面抗原。设置实验分组:空白对照组(NC),100 ng/mL NGF刺激组(100 ng/mL NGF)、慢病毒干扰Mage-D1组(SH-Mage-D1)。邻位连接技术检测Mage-D1与经NGF活化后p75NTR结合的变化,并比较不同分组间的结合强度差异。茜素红与ALP染色观察染色,RT-PCR与Western blot检测ALP、Runx2、OCN、BSP、OPN、Col1、Msx1及Dlx1的表达水平。结果组织块贴壁法获得孕19.5 dEMSCs,流式细胞术检测细胞表面抗原结果为CD44、CD90、CD29、CD146,CD105高表达,CD45低表达;邻位连接法检测Mage-D1与经NGF活化后p75NTR的结合随着时间的延长而增多,且实验组与对照组相比结合强度差异具有统计学意义(P<0.05);茜素红与ALP染色结果显示矿化结节与碱性磷酸酶与强度变化一致;RT-PCR与Western blot检测ALP、Runx2、OCN、BSP、OPN、Col1、Msx1及Dlx1在100 ng/mL NGF组最高(P<0.05)。结论Mage-D1在外胚层间充质细胞中可与经NGF活化后的p75NTR直接结合,且二者的结合对EMSCs的矿化有正向调节作用。

MAGE-D1对大鼠牙胚来源外胚间充质干细胞增殖迁移能力的影响

目的研究黑色素瘤相关抗原D1(Melanoma associated antigens,MAGE-D1)对大鼠牙胚来源的外胚间充质干细胞(Ectomensenchymal stem cells,EMSCs)增殖及迁移能力的影响。方法取SD大鼠孕19. 5 d胎鼠牙胚组织,组织块法培养牙胚来源外胚间充质干细胞,流式细胞仪进行外胚间充质干细胞表面分子鉴定CD14、CD29、CD44、CD45、CD90、CD105、CD146、CD166和p75NTR,MAGE-D1 siRNA转染入外胚间充质干细胞,实验组分为:对照组(Control)和MAGE-D1 siRNA组(MAGEsiRNA-EMSCs),CCK8法和划痕法分别检测两组细胞增殖能力与迁移能力,Real Time-PCR及Western blot检测迁移及WNT通路相关基因MAGE-D1、β-catenin、E-cadherin的mRNA及蛋白表达量。结果组织块法成功培养出牙胚来源的外胚间充质干细胞,经流式细胞仪检测细胞阳性表达CD14(92. 16%)、CD29(94. 53%)、CD44(99. 51%)、CD90(95. 18%)、CD105(34. 22%)、CD146(92. 39%)、CD166(98. 15%)和p75NTR(88. 56%),阴性表达CD45(0. 5%);CCK8法检测MAGE-D1 siRNA组EMSCs增殖能力受到抑制;划痕试验法检测MAGE-D1 siRNA组细胞48 h迁移量高于对照组细胞;Real Time-PCR检测Mage-D1、β-catenin和E-cadherin表达量,MAGE-D1 siRNA组EMSCs MAGE-D1和E-cadherin表达较对照组低,而β-catenin表达较高,Western blot检测MAGE-D1、β-catenin和E-cadherin表达水平趋势与Real Time-PCR结果相一致。结论抑制EMSCs中MAGE-D1的表达上调β-catenin,下调E-cadherin,能够提高细胞的迁移能力,但是其导致增殖能力降低,MAGE-D1可能作为EMSCs迁移增殖能力的关键因子。

Mage-D1的分子生物学特性及参与牙发育调控的研究进展

黑色素瘤相关抗原D1(Mage-D1),也称为NRAGE或Dlxin-1,来自于黑色素瘤抗原(Mage)家族,隶属于MageⅡ类蛋白。目前已有大量研究表明,Mage-D1能够与多种蛋白结合,例如神经生长因子受体(p75NTR)、骨形态发生蛋白(BMP)、X连锁凋亡抑制剂(XIAP)、轴突导向受体(UNC5H1)、Necdin等,从而在细胞分化、增殖、周期、凋亡等方面发挥作用,近年来研究发现,Mage-D1与牙发育的关系密切。该文就Mage-D1的生物学功能及其与牙齿发育的关系作一综述,为揭示牙发育分子信号机制、促进牙齿组织工程进程提供参考依据。

Mage-D1的结构与生物学功能

Mage-D1是黑素瘤相关抗原MAGE家族Ⅱ类的一个成员,不仅具有该家族所共有的MAGE保守序列MHD结构域,其N端还包含MHD2结构域和WQXPXX多肽重复结构域。与MAGEⅠ类成员不同的是,Mage-D1的功能并不限于胚胎发育、生殖细胞发育和肿瘤发生上。近年研究表明,Mage-D1是p75NTR,UNC5H1,XIAP,Dlx/Msx,Ror2等分子的相互作用蛋白,它在细胞存活、凋亡以及细胞周期和分化中发挥重要调节功能。更为重要的是,MAGE家族Ⅱ类另一个主要成员源自神经分化EC细胞蛋白necdin促进神经元和肌细胞分化的功能,是通过Mage-D1调节Dlx/Msx家族成员的转录活性实现的。本文主要就近年关于Mage-D1结构和生物学功能的研究进行综述和分析。

黑色素瘤相关抗原D1在小鼠牙发育过程中的动态表达规律与调控作用研究

目的研究黑色素瘤相关抗原D1(mdanoma associated antigen D1,Mage-D1)在小鼠出生后不同牙发育阶段的动态表达规律,以及敲除Mage-D1在体内对小鼠牙发育造成的影响。方法C57-BL/6野生型乳鼠分为出生后1、4、7、11、15 d等5组(n=3),HE染色观察出生后小鼠下颌第一磨牙的发育动态,免疫组织化学染色观察Mage-D1及同源盒基因Dlx1、Msx1在小鼠出生后牙发育不同阶段的表达情况。选择出生后1、3月龄的Mage-D1纯合敲除鼠(knockout type,KO)、野生小鼠(wild type,WT)进行表型观察(n=6),并对下颌骨进行Micro-CT扫描,分析牙齿及下颌骨的相关数据。结果小鼠出生后第1天,下颌第一磨牙处于钟状晚期,无明显的硬组织形成;第4天,牙本质与牙釉质交替形成,牙冠开始发育;第7天,上皮根鞘形成,牙根开始发育;第11天,牙釉质及冠部牙本质发育基本完成,牙根约发育至一半;第15天,牙根进一步发育,达到2/3以上,牙骨质形成。从小鼠出生后1~15 d,Mage-D1及同源盒基因Dlx1、Msx1全程在成釉细胞及成牙本质细胞中呈阳性表达。与WT小鼠相比,KO小鼠体质量明显增加(P<0.05);牙齿在数目上与野生型小鼠一致,但外观上稍有差异,表现为切牙不易着色以及磨牙更易磨损。但牙及牙槽骨的密度未发现明显差异。结论Mage-D1与Dlx1、Msx1可能共同参与了小鼠牙釉质及牙本质的形成;Mage-D1基因敲除小鼠出现肥胖体征同时牙齿表型发生改变。