单粒蔬菜种子DNA快速提取方法的建立

利用磁珠法对甘蓝、白菜、芥菜、洋葱、黄瓜、番茄、辣椒等7种形状、大小不同的蔬菜单粒种子和幼苗进行DNA提取,采用内参基因Actin进行实时荧光定量PCR评价DNA质量,利用KASP(kompetitive allele specific PCR)标记检验DNA质量是否达到KASP检测要求。结果显示,单粒种子磁珠法提取的各蔬菜DNA平均Ct值均处于19~24范围内。KASP检测进一步证实种子提取DNA的质量达到KASP标记分型的要求。综上所述,本研究建立了一种简单、经济、实用性强的单粒种子DNA提取方法,该方法对不同大小的蔬菜种子具有较好的稳定性,且大幅缩短了获得基因型数据的时间。

DNA提取方法对实时荧光定量PCR检测花生过敏原Ara h 2基因的比较研究

食物过敏是一个世界性的公共卫生问题,其中花生过敏最为严重。基于DNA的分子生物学检测方法目前已广泛应用于花生过敏原检测,样品DNA的提取质量会显著影响检测的灵敏度及准确率。本研究比较了5种DNA提取方法,包括十六烷基三甲基溴化铵(cetyl trimethyl ammonium bromide,CTAB)法、柱式法及3种基于磁珠纯化技术的DNA快速提取法,对生花生、煮花生、炸花生、烤花生、花生酥和花生酱6种不同加工方式的花生基质样品进行DNA提取,考察了不同方法获得的DNA浓度、纯度指标,并采用实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,qPCR)对花生过敏原Ara h 2基因进行了检测分析。结果表明,月桂酰肌氨酸钠(Sodium Lauroyl Sarcosine)磁珠法的适用性广、提取率高,对于6种花生基质提取的DNA均能高效检出花生过敏原Ara h 2基因;对于花生质量分数为0.05%~1.00%的小麦粉二元混合物,SLS磁珠法的DNA提取率总体优于CTAB法,并且能有效提取出与花生共用1条生产线的燕麦片中污染的花生DNA,证实SLS磁珠法提取的实际样品DNA能够满足花生过敏原检测目的。本研究为花生及其制品DNA提取方法提供了参考,特别是磁珠类方法,高效快速,提取质量能够保障后续基于DNA的花生过敏原分子生物学方法检测结果的准确性。

粮食真菌DNA快速高通量提取方法的建立与应用

目的 建立一种高效、快速、高通量的粮食中真菌DNA提取和分析方法,并应用于小麦产脱氧雪腐镰刀菌烯醇(deoxynivalenol,DON)镰刀菌污染状况研究。方法 基于磁珠纯化技术,开发了一种粮食基质中真菌DNA的快速提取方法—月桂酰肌氨酸钠(sodium lauroyl sarcosine,SLS)磁珠法,结合前期采用实时荧光定量聚合酶链式反应法(quantitative real-time polymerase chain reaction,q PCR)和微滴式数字PCR法(droplet digital PCR,dd PCR)建立的小麦中3-乙酰基脱氧雪腐镰刀菌烯醇(3-acetyldeoxynivalenol,3ADON)和15-乙酰基脱氧雪腐镰刀菌烯醇(15-acetyldeoxynivalenol,15ADON)两种产DON毒素化学型镰刀菌及禾谷镰刀菌复合群分析方法,对其提取效果进行了验证并分析了我国2021年新收获小麦产DON镰刀菌的污染水平。结果 与十六烷基三甲基溴化铵(cetyltrimethylammonium bromide,CTAB)法、柱式法试剂盒和磁珠法试剂盒相比较,本研究建立的SLS磁珠法裂解过程无需水浴,配合自动化提取设备工作,整个提取时间小于1 h。对禾谷镰刀菌复合群的提取率最优,而对3ADON和15ADON化学型镰刀菌的提取率与经典CTAB法、磁珠法试剂盒没有显著性差异,并且显著优于柱式法试剂盒。在对2021年收获的120个小麦样品监测结果显示,产DON镰刀菌的生物量与DON毒素水平之间具有极显著的相关性(P<0.01)。结论 SLS磁珠法适用于从基质复杂的粮食样品中提取真菌DNA,操作简便快速、提取率高,更易实现大样本量的分子生物学准确定量检测需求。

一种新型微流体DNA提取芯片的研究

介绍了一种新型的DNA提取纯化芯片,采用多层微细加工技术制作SU-8模具,制作含有微柱的三维立体结构的PDMS(聚二甲基硅氧烷)芯片,在微池内填充超顺磁性磁珠,利用固相提取法,对生物样品中的DNA进行有效快速提取。微柱结构能有效促进反应液混合。整个流程快速有效,无需离心,操作简便且易于芯片集成,能在30 min内完成PCR产物的提纯。成功对大肠杆菌裂解液中的DNA进行了提取,提取产物可直接作为PCR反应的模板,较好地避免了非特异扩增的影响。

硅羟基磁珠的制备及全基因组DNA提取优化

旨在制备硅羟基功能化纳米磁珠与核酸提取试剂,并对提取过程进行优化。采用溶剂热法制备硅羟基功能化纳米磁珠,并用表面化学修饰法在磁珠表面包裹SiO_2;在自制磁珠提取过程中分别对比缓冲液浓度、裂解液浓度、磁珠量以及洗脱温度等因素对DNA提取效率的影响,使用紫外分光光度计定量测定和琼脂糖凝胶电泳定性验证,并与商品化磁珠试剂盒提取效果进行对比。结果显示,通过水热法成功合成了粒径在200 nm左右的Fe_3O_4@SiO_2磁珠,当磁珠量为1.5 mg,裂解液为含5 mol/L的盐酸胍溶液(p H4.9),缓冲液体系为含60%无水乙醇的60 mmol/L盐酸胍缓冲液(pH7.5),洗脱温度为65℃时,所提取的核酸效果达到最优,且4个因素对浓度的影响均存在统计学差异(P<0.05)。利用自制磁珠和试剂体系可高效的完成全血中全基因组DNA的提取,且优于商业化试剂盒。

藏酋猴毛干DNA的3种提取方法

为寻求一种从藏酋猴毛干中提取总DNA的有效方法,从一藏酋猴个体背部剪取数量不等的毛干样品(不含毛囊),经蛋白酶K消化后,分别采用高盐沉淀抽提法、酚氯仿抽提法、纳米磁珠抽提法分离获得用于PCR扩增的模板DNA,通过紫外分光光度计测定OD值并计算出质量浓度,同时进行琼脂糖凝胶电泳和PCR扩增检测,分析3种方法提取藏酋猴毛干DNA的质量差异。每处理设置10个重复。结果表明,纳米磁珠法提取藏酋猴毛干中DNA是一种快捷、简便、经济、高效、安全的有效方法;进行毛发取样时以5～10根较为合适。

天牛幼虫保存与DNA提取方法比较研究

为了开展天牛科昆虫分子系统学研究,采用酚-氯仿提取法、TakaraDNA快速提取试剂盒及GenMagBio动物细胞组织/细胞基因组DNA磁珠提取试剂盒3种方法分别对75%乙醇常温保存、无水乙醇-20℃冷藏保存和活体4℃保存3种保存方式且保存时间1年以上的松墨天牛幼虫进行DNA提取,并对不同提取方法所获取的DNA纯度与质量进行分析比较,确定了长时间保存天牛幼虫以无水乙醇浸渍-20℃冷藏保存效果最佳,而用GenMagBio磁珠法提取试剂盒提取DNA出现降解的标本提取效果最好。应用GenMagBio磁珠提取试剂盒对实验室保存多年的天牛幼虫标本进行DNA提取,并对提取DNA是否适合后续的PCR扩增及DNA序列测定进行了实验验证,结果符合预期。

单粒精米的DNA磁珠法高效率提取技术研究

【目的】文章研究了利用磁珠法高效率提取单粒精米DNA的技术方法。【方法】以4份市售大米为材料,利用磁珠吸附法从单粒精米样品中提取基因组DNA并进行PCR扩增,进行提取效率的检测。【结果】提取的20份基因组DNA条带整齐、无弥散、质量高,浓度均在1 ng/μl以上;进一步,以提取液为模板,利用SSR引物RM247和RM282进行PCR扩增,电泳检测后分别得到180和120 bp的目标条带。【结论】利用磁珠法提取的单粒精米DNA可以直接用于PCR反应;结果为特殊目的或稀缺材料的微量DNA提取检测提供技术支持。

磁珠法快速提取基因组DNA的实验研究

针对临床标本基因组DNA的提取方法缺乏广泛适用性,提取步骤繁琐,需要进行离心操作,并且提取过程中会用到苯酚、氯仿等有机试剂,会对操作人员有一定的危害性等不足,本研究拟建立一种适用于临床标本的基因组DNA快速提取方法。在传统的基因组DNA提取试剂和方法的基础上,本研究采用二氧化硅修饰的超顺磁珠设计了一种基因组DNA快速提取方法;探讨磁珠用量、裂解液p H、盐酸胍浓度等因素对基因组DNA提取效率的影响并采用凝胶电泳实验进行验证。当磁珠用量在50~100μg/100 mg样品,裂解液p H约为6,盐酸胍的浓度为6 mol/L时基因组DNA提取效果好、效率高,且磁珠的用量与吸附表面积成正比,但达到一定用量后不会增加提取量,对于100 mg肺组织,适宜的磁珠用量为80μg。此基因组DNA提取方法高效省时,简便快捷,性价比高,适用临床大量样本基因组DNA提取。

超强磁性微球提取深加工转基因食品DNA

将磁性微球提取基因组核酸方法与实时荧光定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)相结合,建立食品中转基因成分快速检测的新方法。以大豆和马铃薯的深加工食品为研究对象,考察磁性微球对基因组核酸的提取效率。通过聚合酶链式反应(PCR)和qRT-PCR对所提取的DNA样品进行分析,并与市售试剂盒等方法进行比较。结果表明,本方法提取的DNA模板的完整性、纯度、可扩增性以及qRT-PCR反应适用性均良好,甚至超过市售试剂盒的提取效果,特别适用于大豆油和马铃薯淀粉等深加工食品中的基因片段提取。

国产磁珠Wawasye试剂盒在法医DNA中应用

目的探讨国产磁珠Wawasye试剂盒在法医DNA检案中的应用效果。方法利用475份各类常见生物检材测试其效果,并与M48磁珠试剂盒作比较。结果国产磁珠Wawasye试剂盒与M48磁珠试剂盒在检验各类常见生物检材的结果无显著性差异。结论国产磁珠Wawasye试剂盒适用于公安机关DNA实验室。

磁珠DNA自动提取系统在法医检验中的应用

磁珠DNA自动提取系统是将磁珠分离技术与DNA自动提取工作站结合运用,以达到高效提取DNA的目的,它具有操作时间短、准确性高、检材用量少等特点,特别适用于大批量生物检材的快速提取,是目前主流的DNA自动化提取方法。本文对磁珠DNA自动提取系统的基本组成、工作原理、操作流程及其在法医检验领域中的应用等进行了综述,并对该系统的发展前景进行了展望。

两种磁性纳米颗粒(Fe_3O_4、Fe_3O_4@柠檬酸)的制备及其在DNA提取分离中的应用

采用溶剂热法制备表面修饰柠檬酸的磁性Fe_3O_4纳米粒子和磁性Fe_3O_4纳米粒子,并对其粒径大小、晶体结构和磁性能进行表征,并考察其用于DNA提取分离的效果。结果表明,两产物均为立方晶系的Fe_3O_4纳米颗粒。磁性Fe_3O_4纳米粒子和表面修饰柠檬酸的磁性Fe_3O_4纳米粒子的平均粒径为411.1nm和586.3nm。当全血体积200μL、磁性纳米粒子用量2.0mg时,提取的DNA浓度最高分别为270.6ng/μL(Fe_3O_4)和466.4ng/μL(Fe_3O_4@柠檬酸)。

磁珠法DNA提取技术在多重连接依赖探针扩增检测中的应用

目的探讨磁珠法DNA提取技术在多重连接依赖探针扩增(MLPA)检测样品制备中的应用价值。方法分别用半自动磁珠法和手工离心柱法提取1例21-羟化酶缺乏症患者和16例健康男性外周血、16例羊水细胞标本的基因组DNA,用MLPA法检测CYP21A2基因拷贝数,比较两种方法制备DNA的质量及MLPA结果。用磁珠法提取200例羊水细胞DNA,MLPA法检测染色体非整倍体异常表达情况。结果磁珠法提取外周血DNA的浓度和总量均高于离心柱法(P<0.05)。两种方法提取羊水DNA浓度相当,磁珠法所得总量较高(P<0.05)。21-羟化酶缺乏症患者CYP21A2基因拷贝数比值接近0.5。200例羊水标本中检出正常二倍体188例,21三体9例,18三体2例,特纳(Turner)综合征(45,X)1例,与核型分析结果一致。结论磁珠法制备的外周血和羊水细胞DNA适用于MLPA检测,具有较高的应用价值。

MP-120工作站批量提取法医样本DNA

本文运用MP-120自动化DNA提取仪对72份血斑检材进行DNA提取扩增,荧光检测信号均值在200-3000RFU之间,表明所建立的MP-120工作操作程序在血斑的批量提取方面具有较高的成功率、稳定性和均一性,适用于法医DNA数据库的建立和案件中血斑样本的批量提取。

乙肝病毒DNA检测2种不同核酸提取方法的性能验证情况分析

目的:对乙肝病毒DNA(HBV-DNA)检测的2种不同核酸提取方法,即手工法(煮沸法)和全自动核酸提取仪法(磁珠法),在使用相同的检测试剂和核酸扩增仪的条件下进行性能验证,以评价其验证结果。方法:依据《医学实验室质量和能力认可准则》《全国临床检验操作规程》等相关文件,由同一操作人员应用中山达安公司生产的HBV-DNA检测试剂盒和ABI7500实时荧光核酸扩增仪,分别采用手工法和全自动核酸提取仪法提取HBV-DNA进行临床样本的批内精密度、批间精密度、正确度、线性范围性能验证实验。结果:手工法的高值血清批内精密度为2.18%,低值血清批内精密度为3.76%;高值质控品批间精密度为3.29%。全自动核酸提取仪法的高值血清批内精密度为1.78%,低值血清批内精密度为2.44%;高值质控品批间精密度为2.84%。正确度验证分别取浓度为2.0×10^3、2.0×10^4、2.0×10^5、2.0×10^6copies/ml的可溯源标准品进行验证,手工法偏倚分别为-4.88%、-2.51%、-2.46%,-2.12%,全自动核酸提取仪法偏倚分别为-2.37%、-0.95%、0.74%、-1.33%。线性范围验证中,手工法和全自动核酸提取仪法的相关系数分别为0.9660、0.9858,均能满足临床检测的需求。结论:全自动核酸提取仪法较手工法提取核酸有利于简化HBV-DNA提取流程,实现分子生物实验室自动化提取核酸。

“新工科”背景下生物制药专业多学科交叉融合的探索研究——以Fe_(3)O_(4)@SiO_(2)核壳磁性纳米粒子的制备及应用实验为例

“新工科”背景下,多学科交叉融合已成为生物制药专业教学育人的新方式,对培养“明德求真,弘药济世”的卓越应用型工程人才具有重要意义。本文将以Fe_(3)O_(4)@SiO_(2)核壳磁性纳米粒子的制备及应用实验为例,顺应教育部“三全育人”的战略要求,在调动学生科研的积极性和主动性的同时,探索生物制药与有机化学之间的联系,挖掘多学科交叉融合的独特优势,提高学生的科学探究能力和实验操作能力。

表面电性可控磁珠微流控芯片在DNA提取中的应用

制备了表面电性可控的氨基化SiO_2@Fe_3O_4磁性复合微球,采用激光刻蚀和热压键合的方法制作了聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)材质的DNA固相萃取芯片,将磁珠灌注于芯片通道中,借助永磁铁固定并控制磁珠,将磁珠芯片应用于人类全血中的基因组DNA提取,优化了提取实验条件,并对提取产物进行凝胶电泳和PCR分析。实验结果表明,磁珠微流控芯片成功地从全血中提取出纯度较高的基因组DNA,提取效率约35%,提取液的凝胶电泳条带与商品化试剂盒提取的基因组DNA一致,提取液可用于进一步的PCR反应。

干制羊肉基因组DNA不同提取方法的比较

为了研究干制加工羊肉基因组DNA的最佳提取方法,本试验采用传统酚-氯仿法、磁珠法、改良CTAB法、离心柱法分别提取干制处理后的羊肉基因组DNA,并对4种方法提取的羊肉基因组DNA浓度、纯度、完整性以及提取所需时间、PCR扩增效果等进行比较。结果表明,采用磁珠法提取DNA的效果更好,DNA浓度为118.87 ng·μL-1,A260/A280值为1.89,而且此方法具有提取时间短、效率高、污染小等特点。本研究结果为干制加工羊肉基因组DNA的大批量提取和检测提供了参考依据。

高通量半自动基因组DNA提取仪的开发与应用

大规模高质量基因组DNA的提取是植物分子生物学研究的基础,是作物种质资源鉴定、重要农艺性状调控基因的正向定位克隆、作物基因组标记分子辅助育种的重要技术环节。然而,目前常规的单管离心法效率不能满足大规模提取需要,整板离心法及全自动高通量核酸提取仪对设备和耗材要求较高,实验室常用的传统离心方法步骤较为繁琐,涉及较多有机溶剂,耗时较长,成本较高,不太适用于大批量植物材料。为了满足一般实验室大规模、低成本、高质量DNA提取的需求,我们开发了一套半自动DNA提取仪、配套耗材和钢珠分样器,并开发相应DNA提取流程和试剂。应用高通量、高效率的磁珠法吸附DNA,目的是建立简化、快速、高效且安全的植物组织基因组DNA提取方法。通过对小麦、水稻、玉米等主粮作物,以及部分种类的杂粮、油料、蔬菜等植物组织进行DNA提取,并用琼脂糖凝胶电泳、Qubit等方法对DNA完整性和纯度检测,结果表明:(1)磁珠法提取的植物基因组DNA质量与纯度高、完整性好、无降解且无盐离子、有机物等污染;(2)提取过程无需反复对每个样品进行标注,试剂少、步骤少、操作简单快速且成本低,平均每人每天可提取2000个样品;(3)所得DNA样本可应用于基因克隆,转基因检测、CRISPR编辑检测等多种分子实验,也可用于多种NGS(Next Generation Sequencing)建库的高通量深度测序检测。因此,基于磁珠法的DNA纯化方案为植物研究提取DNA提供了一种简单、高效且经济的方法。