用Midi MACS方法从白血病患者分选CD34^+/CD123^+细胞

本研究的目的是应用MidiMACS方法从急性髓系白血病(AML)患者骨髓细胞分选CD34+/CD123+细胞。首先,用淋巴细胞分离液从AML患者骨髓细胞分离单个核细胞(BMMNC),然后再通过MidiMACS方法相继分选出CD34+细胞,以及从CD34+细胞中分选出CD123+细胞并通过流式细胞术分析分选后细胞的富集度和回收率。结果显示:经过第一次分选后,CD34+细胞的富集度高达98.73%,平均为95.6%,其回收率最高可达到84.6%,平均为51%;第二次分选后,CD34+/CD123+细胞的富集度高达99.23%,平均约为83%;相对于分选前BMMNC而言,CD34+/CD123+细胞的回收率为34%,但相对于第一次分选后的CD34+细胞而言,其回收率为56%。结论:MidiMACS方法可用于AML患者骨髓CD34+/CD123+细胞的分选,分选后细胞的富集度和回收率与文献报道的通过FACS方法所获得的结果相类似。

性别控制技术在畜牧业中的应用研究现状与发展

随着生活水平的提高,人们对肉、奶等畜禽产品的需求也不断提高,因此畜禽繁育工作就显得尤为重要,而性别控制技术是加快畜禽繁育工作的重要环节,其是一类通过人为干预方式来控制畜禽后代性别以满足市场需求的技术。目前生命科学领域发展迅速,已经有多种相对成熟的性别控制技术,如流式细胞仪分选法、免疫学分离法、改变精子生存环境法、基因编辑法、磁性细胞分选(magnetic activated cell sorting,MACS)法等,笔者对上述性别控制技术进行综述,以期为性别控制技术在畜牧业中的应用提供参考。

Nycodenz-密度渗透压介质离心分离人外周血单核细胞研究

目的研究人外周血单核细胞分离方法。方法采集24名健康志愿献血者外周血,分别以EDTA-K2、肝素钠、枸橼酸钠抗凝,将抗凝全血或单个核细胞悬液缓慢加入不同密度和渗透压组合的Nycodenz-NaCl溶液上层,离心分离单核细胞;EDTA抗凝血经Ficoll-Hypaque密度梯度离心获得的单个核细胞,再分别用Nycodenz-NaCl密度渗透压介质离心法、Percoll密度梯度离心法、贴壁法、MACS(抗CD-14磁珠)分离单核细胞。结果如上4种方法获得的单核细胞纯度和收获率中位数(M)分别为98.9%和68.5%、89.6%和64.5%、64.8%和60.5%、94.1%和73.5%,比较显示Nycodenz法获得的单核细胞纯度最高(P<0.01);吞噬指数和趋化指数分别为188.8±11.2和26.8±5.9、187.8±12.2和26.1±5.1、144.4±24.8和15.4±7.3、177.1±18.3和18.9±6.7,统计表明Percoll法和Nycodenz法获得的单核细胞的吞噬指数、趋化指数高于贴壁法和MACS法(P<0.05);单核细胞受LPS刺激分泌细胞因子IL-12p70、IL-10、TNF-α水平(pg/ml)分别为2 545±341、1 216±397、3.999±418,2 489±425、1080±277、3 891±446,2 147±223、794±180、3268±411,35±12、142±81、407±199,比较得知MACS的单核细胞受LPS刺激分泌细胞因子IL-12p70、IL-10、TNF-α水平非常显著低于其他方法(P<0.01);单核细胞经典亚群CD14+CD16-HLA-DR+百分比和非经典亚群CD14+CD16+HLA-DR+百分比(M)分别为89%和5%、88%和1%、73%和1%、51%和36%,统计表明MACS法的单核细胞经典亚群百分比明显低于其他分离方法(P<0.01),而非经典亚群百分比明显高于其他方法(P<0.01)。结论 Nycodenz-NaCl密度渗透压介质离心法能够分离获得较高纯度、较多经典型的单核细胞。

人鼻咽癌细胞株中类肿瘤干细胞的分离、培养及鉴定

目的检测CD133在人鼻咽癌细胞株SUNE中的表达以及CD133+肿瘤细胞的体外增殖、分化情况,并对其进行类肿瘤干细胞的鉴定。方法采用免疫荧光细胞化学技术及流式细胞仪检测鼻咽癌细胞株SUNE中CD133的表达情况以及CD133+细胞体外分化能力;免疫磁珠分选技术纯化CD133+肿瘤细胞;MTT法检测CD133+细胞的体外增殖能力,并将其与CD133-及未分选细胞进行比较。结果鼻咽癌细胞株SUNE中有0.35%的微量细胞呈CD133+表达;免疫磁珠富集的CD133+肿瘤细胞在无血清培养基中悬浮生长,并可以形成肿瘤细胞球,具有很强的自我更新和繁殖能力,且在3、5、7 d的紫外吸光度(A)值分别为0.317±0.007、0.370±0.002、0.558±0.004,均高于相同条件下未分选细胞和CD133-细胞(P<0.05);CD133+细胞在含血清培养基中的比例逐日下降,至培养的第12天,由第1天的89.67%下降至0.37%。结论CD133可作为鼻咽癌类干细胞的标志之一。鼻咽癌细胞株SUNE中存在类肿瘤干细胞,并具有自我更新和分化能力。

免疫磁性活化细胞分选方法优化及纯化后细胞的生物学特性检测

目的:改良常规免疫磁性活化细胞分选(MACS)的分离纯化方法,提高分选后细胞的纯度并确保细胞仍具有良好活性及功能。方法:以干细胞抗原-1(Sca-1)标记的Sca-1+造血干/祖细胞(Sca-1+HSC/HPC)为例,分别用改良后和常规MACS法分选出小鼠骨髓细胞Sca-1+细胞,流式细胞术检测两种分选方法获得Sca-1+细胞纯度;计算阳性细胞回收率;台酚蓝染色检测分选细胞存活百分率;CCK-8检测细胞增殖,混合造血祖细胞(CFU-Mix)体外培养评价分选Sca-1+细胞分化能力。结果:改良MACS法分选获得的Sca-1+细胞纯度达93%以上(常规MACS法仅为87%),阳性细胞的回收率可达73%(常规法仅为62.3%);细胞存活率、细胞增殖和CFU-Mix集落形成能力两种分选方法无明显差别。结论:改良法能明显提高细胞分选纯度及回收率,细胞活性和功能保持良好,值得各种细胞免疫磁性分选参考采用。

CD133阳性/阴性肺癌细胞的分选、鉴定及差异基因的筛选

背景与目的研究表明多种实体肿瘤中存在肿瘤干细胞(cancer stem cells,CSCs),肿瘤干细胞与非肿瘤干细胞的生物学特性存在已有的明显差异,而CD133被认为是肿瘤干细胞的标记物,因此CD133阳性细胞与CD133阴性细胞可能存在明显差异。本研究通过分选人肺腺癌A549细胞中的CD133阳性及CD133阴性细胞,鉴定两组细胞的生物学特性并在人组织标本进行验证,利用基因芯片筛选转移相关差异基因。方法采用磁式分选(magnetic activated cell sorting,MACS)的方法对人肺腺癌A549中CD133阳性细胞、CD133阴性细胞进行分选,通过无血清条件培养、平板克隆、血清诱导分化及基因芯片等实验,比较两组细胞"sphere"形成、细胞增殖、细胞分化以及差异基因,并在人组织标本进行CD133表达与临床特性的验证分析。结果 CD133阳性细胞能在无血清培养基中悬浮生长并形成"sphere";其平均克隆形成率(57.1%)明显高于CD133阴性细胞(3.3%);CD133阳性细胞能被血清诱导分化、表达腺癌标志物CK7;两组细胞中的19个转移基因表达水平相差两倍或以上,差异最高达12倍;肺癌组织中CD133阳性细胞主要分布于癌巢周边,数量稀少,其表达与肿瘤组织学分型、分级及临床分期无关。结论 CD133阳性肺腺癌A549细胞具有CSCs特性;两组细胞在转移相关基因的表达存在明显差异,其中CD82可能在CD133阳性细胞的转移机制中起重要作用。

人脑恶性胶质瘤微血管内皮细胞的分离培养与体外血管生成特性

目的 建立人脑恶性胶质瘤微血管内皮细胞 (glioma derivedmicrovascularendothelialcells ,GDMEC)体外培养体系并观察其体外毛细血管样结构形成特性。方法 采用胰酶、胶原酶联合消化法分离人脑恶性胶质瘤微血管片段 ,利用结合CD10 5抗体的MACSMicroBeads免疫磁珠内皮细胞分选系统纯化GDMEC ;应用光镜、透射电镜和免疫细胞化学等技术对所获得的GDMEC进行鉴定 ;采用三维培养模型 ,观察GDMEC受血管内皮生长因子 (VEGF)诱导下的小管样结构 (TLS)形成的特性。结果 所获GDMEC呈FⅧ RAg阳性 ,细胞纯度可达 98% ;电镜下见Weibel Palade小体 ;生长状态良好、可传代培养。这些细胞对VEGF刺激具有良好的反应性 ,体外易于形成TLS。结论 本研究摸索并建立了人脑GDMEC的分离培养方法 ,所获GDMEC对肿瘤血管生成研究具有重要价值。

免疫磁珠分选人角朊干细胞的实验研究

目的:探索人角朊干细胞(keratinocyte stem cells,KSCs)的免疫磁珠分选(Magnetic Activated Cell Sorting,MACS)的方法。方法:从人包皮组织获得角朊细胞悬液,然后利用人角朊干细胞表面CD49f(整合素α6)和CD71的表达情况(CD49fbriCD71dim)通过MACS法将KSCs分选出来,在荧光显微镜下观察其荧光标记情况,同时将分选所得的CD49fbriCD71dim细胞进行体外无血清培养,观察其形态及克隆形成。结果:人角朊细胞经MACS法分选后所得的CD49fbriCD71dim细胞比率可达12．02(±6．92)%。CD49fbriCD71dim细胞经培养可见细胞为典型的上皮样特征,呈铺路石样形态,高核浆比例,细胞紧密排列,轮廓清楚,折光性好,并可在5-7天左右形成全克隆,符合KSCs的特点。结论:研究表明MACS分选法可以得到较高比例的人角朊干细胞,并能进行后续培养研究,其不失为一种较理想的人角朊干细胞的分选方法。

正负向磁性细胞分选技术纯化血小板方法的比较

目的获得纯化的血小板,为血小板免疫功能的研究提供实验基础。方法应用磁性细胞分选技术纯化血小板;流式法评价纯化后血小板活化率;白细胞绝对计数法评价有核细胞清除率。结果分选前血小板基础活化率为(2.39±1.10)%,负向分选后为(2.56±1.08)%,正向分选后为(16.76±4.04)%;正、负向分选的有核细胞清除率分别为(98.44±0.24)%及(98.47±0.18)%。正负向分选后血小板回收率分别为(76.5±1.49)%及(79.2±2.61%)。结论磁性细胞负向分选技术适合进行血小板纯化。

免疫磁珠分选的基质细胞抗原1(STRO-1)阳性人牙周膜细胞具有多向分化的干细胞特性

目的采用免疫磁珠法(MACS)分选人牙周膜细胞基质细胞抗原1阳性(STRO-1^+)细胞及STRO-1^-细胞,并对两种细胞的干细胞特性进行对比分析。方法组织消化法分离培养人牙周膜细胞,并采用STRO-1抗体结合的免疫磁珠对细胞进行分选。随后使用流式细胞仪检测STRO-1^+细胞和STRO-1^-细胞中表面标志物CD90、CD105、CD29、STRO-1、CD34和CD45的表达;采用集落形成实验检测分离细胞的集落形成率;在成骨和成脂诱导分化后,分别采用茜素红染色和油红O染色鉴定其多向分化能力。结果STRO-1^+细胞可高表达干细胞表面标志物CD90和CD105,而低表达造血细胞标志物CD34和CD45;并且STRO-1^+细胞的集落形成率显著高于STRO-1^-细胞;STRO-1^+细胞具有向成骨和成脂细胞分化的潜能。结论采用免疫磁珠法分选的STRO-1^+细胞为具有干细胞特性的人牙周膜干细胞。

两种免疫磁珠分离法分选小鼠骨髓粒-单核祖细胞的效率比较

目的:提取小鼠骨髓细胞(bone marrow cell,BMC),用两种不同的免疫磁珠分离(magnetic activated cell sorting,MACS)试剂盒从小鼠BMC中分选提纯粒-单核祖细胞(granulocyte-monocyte progenitor,GMP),比较这两种免疫磁珠的分选效率。方法:从小鼠股骨和胫骨中提取BMC,通过两种不同的MACS试剂盒,即Lineage阳性细胞清除试剂盒和CD117阳性细胞分选试剂盒,分别得到Lineage-细胞群和CD117+细胞群,用代表GMP细胞表面标志物的荧光抗体标记,孵育后通过流式细胞荧光分选技术得到GMP细胞,并且对比得到GMP细胞的效率。结果:每2只野生型C57BL/6J小鼠可共收集骨髓细胞(7.02±1.24)×10^(7)个,细胞活力为(91.86±5.24)%。经过Lineage阳性细胞清除试剂盒得到的细胞数量为(5.71±2.86)×10^(6)个;经过CD117阳性细胞分选试剂盒得到的细胞数量为(2.70±0.56)×10^(6)个。Lineage磁珠分选纯化得到的GMP细胞数占总细胞数的比例为(10.90±1.37)%,CD117磁珠分选纯化得到的GMP细胞数占总细胞数的比例为(4.83±2.08)%。结论:Lineage阳性细胞清除试剂盒能更有效分选小鼠骨髓细胞中的粒-单核祖细胞。

免疫磁珠分选与顺铂富集喉癌Hep-2细胞系中肿瘤干细胞的比较

目的比较免疫磁珠分选（MACS）及化疗药物顺铂（DDP）筛选富集喉癌Hep-2细胞系肿瘤干细胞的效果。方法以CD133MACS、DDP作用两种方法来富集喉癌Hep-2细胞系中的肿瘤干细胞，并以流式细胞术（FCM）检测处理后CD133^＋细胞的百分率。同时观察细胞形态学的改变，判断两种方法分选后细胞对后续实验的影响。结果经FCM检测，MACS分选喉癌Hep-2，CD133^＋细胞得率为64．33％，不同浓度DDP作用于喉癌Hep-2细胞48h，FCM检测CD133^＋细胞有不同的得率，其中质量浓度为4μg／ml时，所得CD133^＋≥细胞百分率最高，为50．7％。MACS与DDP各组比较差异均有统计学意义（P〈0．01）；两种方法处理后MACS组细胞的存活状态要好于DDP组。结论MACS分选纯度较高，对细胞损伤小，适合后续培养；但分选前耗时长，每次分选仅能用于一种Marker。DDP筛选简单易行，符合临床肿瘤干细胞（CSC）抵抗化疗的模式。但阳性细胞得率与细胞毒性成正比。MACS和DDP筛选肿瘤干细胞各有其优势及适用范围，实验中可根据不同目的来确定所用筛选方法。

人工合成树状串联hTERT表位肽对mDC表型和功能的影响

目的 通过对树状串联hTERT表位肽（MAP）与无肽刺激组髓样树突状细胞（mDC）的相关检测,研究MAP肽对mDC的表型和功能的影响.方法 人工固相合成四分支的MAP肽,免疫磁珠分选mDC,流式细胞技术检测相关表面分子.ElISA分别检测两组mDC培养基的IL-12p70含量,并作统计学分析.结果 人工合成MAP肽纯度高（95.26 %）,免疫磁珠分选mDC纯度为72.59 %,相比于无肽刺激组mDC,MAP肽刺激组成熟（培养第9天）时MHCⅡ类分子为83.90 %、MHCⅠ类分子为91.08 %,CD86：77.03 %,CD83：92.16 %;IL-12p70的含量也大于无肽刺激组,且有统计学差异.结论 人工合成hTERT的MAP肽能足够强的激活mDC,刺激其成熟和功能的表达,可作为mDC抗肿瘤疫苗的刺激肽结构.

小熊猫精原干细胞的分选与培养

野生动物的保护手段主要包括就地保护、易地保护与离体保护。精原干细胞(SSCs)是雄性动物维持生殖能力的根本,既能通过自我更新产生新细胞,也能通过分化产生精子,在小熊猫(Ailurus fulgens)离体保护方面具有广阔的应用前景。动物睾丸中精原干细胞数量极少,分离纯化与体外培养对于其研究和应用至关重要。本研究选择整合素α6(ITGA6)蛋白作为精原干细胞分子标记,采用免疫磁珠分选(MACS)技术富集了3月龄小熊猫睾丸中的ITGA6阳性细胞。流式细胞术检测发现分选后ITGA6阳性细胞纯度可达74.27%±8.73%,显著高于分选前(32.60%±3.06%)。将分选后的细胞接种到层粘连蛋白包被的细胞培养板中,用含胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)、表皮细胞生长因子(EGF)与成纤维细胞生长因子(bFGF)的培养基进行体外培养。培养10 d后,在显微镜下可观察到典型的精原干细胞集落,结合逆转录PCR(RT-PCR)和细胞免疫荧光染色发现这些细胞集落特异性表达精原干细胞分子标记蛋白ITGA6、早幼粒细胞白血病锌指蛋白(PLZF)和胸腺细胞分化抗原1(THY1),同时也表达生殖细胞标记蛋白VASA和DAZL。本研究结果证实,ITGA6可作为小熊猫精原干细胞的分子标记用于细胞分选富集,同时初步建立的培养体系也为小熊猫精子发生机制与应用研究提供材料。