核酸纳米材料携带的mTOR小干扰RNA对肺动脉平滑肌细胞自噬和增殖的影响

目的研究自组装核酸纳米材料携带的mTOR小干扰RNA(self-assembled nucleic acid nanoparticles loaded mTOR small interfering RNA,siRNA-NPs)对大鼠肺动脉平滑肌细胞(rat pulmonary arterial smooth muscle cells,RPASMCs)自噬和增殖的影响。方法设计并合成DNA序列m T-2A、m T-1A3以及5'端标记Cy3的mTOR siRNA,共设计mTOR siRNA序列3条,选其中最佳序列,将上述核酸材料按照操作步骤自组装合成三角板型的核酸纳米材料。实验分4组:核酸纳米材料携带的mTOR siRNA组(siRNA-NPs组)、单纯纳米材料组(NPs组)、单独的siRNA组和空白对照组。各组材料分别转染RPASMCs 24 h,激光共聚焦显微镜观察RPASMCs对核酸纳米材料携带的mTOR siRNA的摄取情况;应用RT-PCR检测各组细胞中mTOR mRNA的表达水平,应用Western blot检测p-mTOR、LC3B蛋白的表达水平;激光共聚焦、透射电镜检测细胞自噬水平;MTT及3H-TdR检测各种材料处理后对细胞的生长的影响。结果激光共聚焦显微镜下可见siRNA-NPs组细胞质内均匀分布大量呈颗粒状的红色荧光物质,其荧光强度均显著高于单独的siRNA组(P<0.05);而且siRNA-NPs组处理的mTOR mRNA和p-mTOR蛋白表达显著低于单独的siRNA组、NPs组及空白对照组(P<0.05);而LC3B蛋白表达显著高于其他各组(P<0.05),激光共聚焦检测显示siRNA-NPs组标记自噬小体的绿色荧光明显强于单独的siRNA组、NPs组及空白对照组(P<0.05),电镜结果显示siRNA-NPs能明显诱导细胞自噬小体形成;MTT及3H-TdR检测siRNA-NPs和单独siRNA处理RPASMCs后明显抑制其生长,且siRNA-NPs组细胞生长抑制率又显著高于单独的siRNA组(P<0.01)。结论 siRNA-NPs能被RPASMCs有效摄取并明显抑制靶基因的表达,进而诱导细胞自噬并且抑制其细胞增殖。

沉默GOLPH3基因对胃癌细胞增殖、凋亡的影响及机制探讨

目的观察特异性沉默高尔基体磷蛋白3(GOLPH3)基因对胃癌细胞增殖、凋亡的影响,并探讨其机制。方法将人胃癌SGC-7901细胞随机分为3组,A、B组分别转染LV-GOLPH3-RNAi-1、无义链,C组不转染。转染72h后,采用MTT法检测细胞增殖能力,流式细胞术检测细胞凋亡,Western blot法检测细胞GOLPH3、磷酸化哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(p-m TOR)和m TOR。结果 A组细胞增殖的OD值较B、C组低,细胞凋亡率(2.70%±0.11%)高于B组(0.42%±0.02%)和C组(0.31%±0.02%),细胞GOLPH3、p-m TOR蛋白表达量较B、C组少,P均<0.05;B、C组间各指标比较,P均>0.05。结论沉默GOLPH3基因能抑制胃癌细胞增殖、促进胃癌细胞凋亡,其机制可能与下调m TOR信号通路中关键因子p-m TOR表达有关。

干扰mTOR表达增强食管鳞癌EC9706细胞对雷帕霉素的敏感性

目的:观察哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)特异性小干扰RNA(mTOR-siRNA)干扰mTOR表达后,食管鳞癌EC9706细胞对雷帕霉素(rapamycin)敏感性的变化。方法:mTOR-siRNA转染EC9706细胞,RT-PCR检测干扰效果。mTOR-siRNA转染前后的EC9706细胞用雷帕霉素处理,Western blotting检测EC9706细胞中mTOR及其下游p70S6K蛋白的表达;流式细胞术检测EC9706细胞的周期及凋亡,CCK-8试剂盒检测EC9706细胞的增殖。结果:mTOR-siRNA下调EC9706细胞中mTOR mRNA的表达(P<0.05或P<0.01);雷帕霉素抑制EC9706细胞中mTOR和p-p70S6K蛋白的表达(P<0.05),并促进p70S6K蛋白表达(P<0.01),且mTOR-siRNA转染后此作用更明显(P<0.05)。雷帕霉素可诱导EC9706细胞凋亡(P<0.01)、抑制EC9706细胞增殖(P<0.05或P<0.01)、使EC9706细胞阻滞于G1期(P<0.01),且mTOR-siRNA转染后这些作用更强(P<0.05)。结论:mTOR-siRNA能特异性下调食管鳞癌EC9706细胞中mTOR表达,提高EC9706细胞对雷帕霉素的敏感性。

雷帕霉素及雷帕霉素靶蛋白小干扰RNA对高体积分数氧诱导的早产鼠肺成纤维细胞增殖、凋亡和细胞外基质的影响

目的探讨雷帕霉素及哺乳动物雷帕霉素靶蛋白小干扰RNA（mammalian target of rapamycin－small interfering RNA，mTOR siRNA）对高体积分数氧（高氧）诱导的早产鼠肺成纤维细胞增殖、凋亡及Ⅰ型胶原（collagen Ⅰ，COLⅠ）、Ⅲ型胶原（collagen Ⅲ，COLⅢ）、纤维连接蛋白（fibronectin，FN）表达的影响。方法采用900 mL/L体积分数的氧气制作高氧损伤细胞模型，将早产鼠肺成纤维细胞分为空气对照组、高氧组、高氧＋雷帕霉素组和mTOR siRNA转染组，应用噻唑蓝（MTT）法评估细胞增殖，Annexin V－FITC和碘化丙啶（propidium lodide，PI）双染色法检测细胞凋亡；应用酶联免疫吸附试验（ELISA）法检测COLⅠ、COLⅢ和FN的水平，应用Western blot法检测凋亡相关基因Bcl－2和P53及结缔组织生长因子（connective tissue growth factor，CTGF）和转化生长因子β（transforming growth factor β，TGF－β）的蛋白表达情况。结果与空气对照组比，高氧组肺成纤维细胞增殖减少，凋亡增加，同时COLⅠ（28.30±0.53比17.43±0.37）、COLⅢ（27.86±1.02比17.43±0.37）和FN（32.87±0.42比21.57±0.47）含量及P53（0.810±0.119比0.160±0.018）、CTGF（0.590±0.017比0.220±0.007）和TGF－β（0.580±0.108比0.210±0.008）蛋白表达均增加，Bcl－2（0.150±0.004比0.600±0.130）蛋白表达减少，差异均有统计学意义（均P〈0.01）；雷帕霉素干预后与高氧组对比，肺成纤维细胞增殖增加，凋亡减少，COLⅠ（23.17±0.60比28.30±0.53）、COLⅢ（17.09±0.58比27.86±1.02）和FN（28.11±0.68比32.87±0.42）含量及P53（0.430±0.008比0.810±0.119）、CTGF（ 0.040±0.006比0.590±0.017）和TGF－β（0.380±0.008比0.580±0.108）蛋白表达均减少，Bcl－2（0.290±0.009比0.150±0.004）蛋白表达增加，差异均有统计学意义（均P〈0.01）；mTOR siRNA转染组较高氧＋雷帕霉素组比，肺成纤维细胞增殖增加，凋亡减少，COLⅠ（15.71±0.34比23.17±0.60）、COLⅢ（13.85±1.36比17.09±0.58）和FN（20.18±0.28比28.11±0.68）含量及P53（0.300±0.006比0.430±0.008）、CTGF（0.140±0.004比0.040±0.006）和TGF－β（0.150±0.002比0.380±0.008）蛋白表达均减少，Bcl－2（0.460±0.012比10.290±0.009）蛋白表达增加，差异均有统计学意义（均P〈0.01）。结论雷帕霉素及mTOR siRNA均可保护早产鼠高氧导致的肺损伤，且对肺纤维化有一定的抑制作用，mTORsiRNA效果更明显，其机制可能是通过抑制mTOR信号通路。