Mammalian-like Purple Acid Phosphatases in Plants

Introduction Purple acid phosphatases （PAPs） comprise of a family of binuclear metal-containing hydrolases, some members of which have been isolated and characterized from animal, plant and fungal sources . PAPs not only catalyze the hydrolyses of a wide range of phosphate esters and anhydrides under acidic reaction conditions, but also catalyze the generation of hydroxyl radicals in a Fenton-like reaction, by virtue of the presence of a redox-active binuclear metal center. Inmammals,

通络熄风汤通过调控Mst1/Sirt3信号通路对自发性高血压大鼠心肌损伤程度的影响

目的:探讨通络熄风汤改善高血压大鼠心肌损伤的作用机制。方法:6只Sprague-Dawley大鼠作为空白组,12只自发性高血压大鼠随机分为模型组和通络熄风汤组。空白组和模型组大鼠给予去离子水灌胃,通络熄风汤组给予中药配方颗粒通络熄风汤悬浮液灌胃治疗,连续干预8周。采用蛋白免疫印迹法(Western Blot)检测心肌细胞中自噬受体蛋白1(SQSTM1/P62)、磷酸化哺乳动物无菌20样激酶1(p-Mst1)、沉默信息调节因子3(Sirt3)蛋白的含量,运用苏木精-伊红(HE)染色观察大鼠心肌组织结构变化,以评价通络熄风汤对高血压心肌损伤改善的效果及机制。结果:与模型组比较,通络熄风汤组能够显著改善高血压大鼠的收缩压及舒张压(P<0.01)。通络熄风汤治疗后大鼠心肌细胞与模型组比较,排列情况与坏死状态均有明显改善。通络熄风汤组大鼠心肌组织中的p-Mst1、P62蛋白含量较模型组降低(P<0.01),Sirt3蛋白含量升高(P<0.01)。结论:通络熄风汤可以介导Mst1/Sirt3信号通路对心肌组织细胞自噬水平进行调整,并且保护心脏功能。

不稳定型心绞痛患者血浆RANTES和MST1水平与冠状动脉斑块负荷的相关性

目的:探讨不稳定型心绞痛(UA)患者血浆调节活化正常T细胞表达和分泌因子(RANTES)水平和哺乳动物不育系20-样激酶1(MST1)与冠状动脉斑块负荷的相关性。方法:选择2018年1月至2021年1月在承德医学院附属医院心内科诊断UA且接受冠状动脉造影的住院患者,采用酶联免疫吸附实验法检测入院时血浆RANTES和MST1水平。应用SYNTAX评分和Gensini评分量化冠状动脉斑块负荷的程度。依据SYNTAX评分分为低SYNTAX评分组(≤22)和中/高SYNTAX评分组(>22),分别依据RANTES和MST1三分位数分为低RANTES组、中RANTES组和高RANTES组以及低MST1组、中MST1组和高MST1组。结果:本研究纳入321例UA患者,中/高SYNTAX评分组血浆RANTES和MST1水平高于低SYNTAX评分组,差异有统计学意义(P<0.05)。高RANTES组SYNTAX评分(18.91±6.57)高于中RANTES组(13.69±3.05)和低RANTES组(10.66±6.12)(P<0.05)。高MST1组SYNTAX评分(15.75±6.13)高于中MST1组(14.43±7.51)和低MST1组(13.06±5.28)(P<0.05)。多因素Logistic回归分析提示,RANTES最高三分位数(OR=2.672,95%CI1.173~6.090,P<0.05)和MST1最高三分位数(OR=5.274,95%CI1.769~15.722,P<0.05)是中/高SYNTAX评分的独立危险因素。RANTES和MST1以及两者联合预测中/高SYNTAX评分的ROC曲线下面积(AUC)分别为0.69(95%CI0.586~0.795,P<0.05)、0.625(95%CI0.553~0.696,P<0.05)以及0.786(95%CI0.705~0.866,P<0.001)。结论:血浆RANTES、MST1水平升高是UA患者较高冠状动脉斑块负荷的独立危险因子。

大黄糖络丸通过AMPK/mTOR/ULK1通路调控糖尿病肾病小鼠足细胞自噬的作用机制研究

目的:探究大黄糖络丸(DHT)基于腺苷酸活化蛋白激酶/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白/unc-51样激酶1(AMPK/mTOR/ULK1)信号通路对糖尿病肾病(diabetic nephropathy,DN)小鼠的干预作用。方法:40只造模成功的C57BL/KSJ-db/db(以下简称db/db)小鼠随机分为模型组,达格列净组(1.5 mg·kg^(-1)·d^(-1)),DHT高、中、低剂量组(3.6、1.8、0.9 g·kg^(-1)·d^(-1)),每组8只;另取10只C57BL/KSJ-db/dm(以下简称db/m)小鼠为正常组,正常组和模型组给予生理盐水,治疗组小鼠分别给予相应药物,连续给药10周,1次/d。于给药0、4、8、10周固定时间,禁食不禁水12 h,取尾静脉血检测空腹血糖(FBG);于给药0、5、10周末收集尿液检测尿中白蛋白、肌酐含量,计算尿白蛋白肌酐比值(ACR);给药10周后,检测各组小鼠24 h尿总蛋白,血肌酐(Scr),尿素氮(BUN)含量;蛋白免疫印迹法检测肾脏组织p-AMPK、p-mTOR及p-ULK1蛋白的表达水平,以及自噬关键分子酵母Atg6同系物1(Beclin-1)、微管相关蛋白1轻链3(LC3)、P62蛋白的表达水平;免疫组化法检测肾脏组织足细胞裂孔膜蛋白(Nephrin、Podocin)的表达水平;采用光学显微镜和透射电镜观察肾脏组织病理形态学变化。结果:与模型组比较,达格列净组和DHT组小鼠FBG、ACR、24 h尿总蛋白均降低,Scr、BUN无统计学差异;肾组织中p-AMPK、p-ULK1表达水平升高,p-mTOR表达水平降低及LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin-1表达水平升高,P62表达水平降低(P<0.01,P<0.05);肾小球的足细胞裂孔膜蛋白Nephrin、Podocin表达水平升高(P<0.01,P<0.05);肾脏病理损害减轻;透射电镜显示自噬小体、自噬溶酶体数量增加。结论:DHT可能通过调控AMPK/mTOR/ULK1信号通路,增强足细胞自噬,保护肾小球,延缓DN发展进程。

橙皮素抑制TLR4-mTOR-ULK1信号通路对心肌缺血再灌注损伤大鼠细胞自噬和凋亡的影响

目的 探讨橙皮素(HES)对心肌缺血再灌注损伤(MIRI)大鼠细胞自噬与凋亡的影响,并初步分析其机制。方法 将SD大鼠分为假手术(Sham)组、MIRI组、低剂量HES(HES-L,15 mg/kg)组、高剂量HES(HES-H,30 mg/kg)组和HES-H+Toll样受体4(TLR4)抑制剂(HES 30 mg/kg+复合物C 0.2 mg/kg)组。连续给药7 d,除Sham组外,大鼠采用冠脉结扎法构建MIRI模型,24 h后检测左心室血流动力学参数[包括左室舒张期末压(LVEDP)、左室内压最大上升速率(dp/dtmax)、左室内压最大下降速率(-dp/dtmax)];采用原位末端转移酶标记技术(TUNEL)检测心肌细胞凋亡,氯化三苯基四氮唑(TTC)染色检测心肌梗死(心梗)面积,酶联免疫吸附试验(ELISA)检测心肌组织中丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD);Western blotting检测大鼠心肌组织中微管相关蛋白1-轻链3(LC3)Ⅱ、LC3Ⅰ、自噬效应蛋白(Beclin1)、TLR4、磷酸化(p)-TLR4、雷帕霉素靶蛋白(mTOR)、p-mTOR、unc-51样自噬激活激酶1(ULK1)、p-ULK1蛋白表达。结果 与Sham组比较,MIRI组大鼠心肌细胞线粒体损伤、自噬空泡形成;LVEDP[mmHg(1 mmHg≈0.133 kPa):14.22±2.12比5.44±0.83]、心肌细胞凋亡率[(31.52±4.01)%比(2.41±0.26)%]、心梗面积(mm2:43.68±3.86比0.00)、心肌组织MDA(ng/L:8.25±1.03比3.71±0.65)、p-mTOR/mTOR(0.76±0.08比0.33±0.04)、p-ULK1/ULK1(0.69±0.08比0.22±0.03)均显著升高,dp/dtmax(mmHg/s:3 441.43±289.25比4 910.57±350.12)、-dp/dtmax(mmHg/s:2 588.96±260.23比3 845.94±364.19)、心肌组织LC3Ⅱ/LC3Ⅰ(1.13±0.14比2.35±0.21)、Beclin1(0.35±0.06比0.87±0.09)、p-TLR4/TLR4(0.40±0.05比0.84±0.10)均显著降低(均P <0.05)。与MIRI组比较,HES-L、HES-H组大鼠线粒体损伤缓解,自噬空泡少见;LVEDP(mmHg:11.56±1.60、7.88±1.21比14.22±2.12)、心肌细胞凋亡率[(25.52±3.11)%(、17.54±1.89)%比(31.52±4.01)%]、心梗面积(mm2:36.67±3.58、29.58±3.04比43.68±3.86)、心肌组织MDA(ng/L:6.98±0.65、4.12±0.48比8.25±1.03)、p-m TOR/m TOR(0.60±0.07、0.45±0.05比0.76±0.08)、p-ULK1/ULK1(0.54±0.05、0.32±0.04比0.69±0.08)均显著降低,dp/dtmax(mmHg/s:3 972.82±310.17、4 442.97±396.24比3 441.43±289.25)、-dp/dtmax(mmHg/s:3 152.30±312.18、3 430.57±324.24比2 588.96±260.23)、心肌组织中LC3Ⅱ/LC3Ⅰ(1.76±0.18、2.01±0.20比1.13±0.14)、Beclin1(0.56±0.07、0.79±0.08比0.35±0.06)、p-TLR4/TLR4(0.55±0.06、0.73±0.08比0.40±0.05)均显著升高(均P <0.05)。结论 HES可通过抑制TLR4-m TOR-ULK1信号通路促进MIRI大鼠心肌细胞自噬,抑制凋亡。

汉黄芩素调节AMPK/mTOR信号通路对抑郁症大鼠抑郁样行为的改善作用研究

目的:探究汉黄芩素(Wog)调节AMP活化蛋白激酶(AMPK)/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信号通路对抑郁症大鼠抑郁样行为的改善作用及机制。方法:建立抑郁症大鼠模型,实验分为对照组(Control组)、模型组(Model组)、汉黄芩素低、中、高剂量组(Wog-L、Wog-M、Wog-H组,7mg·kg^(-1)·d^(-1)、14mg·kg^(-1)·d^(-1)、28mg·kg^(-1)·d^(-1)Wog)和汉黄芩素高剂量+AMPK抑制剂Compound C组(Wog-H+Compound C组,28mg·kg^(-1)·d^(-1)Wog+0.14mg·kg^(-1)·d^(-1)Compound C)。采用蔗糖偏好、旷场实验和强制游泳实验观察大鼠抑郁样行为;ELISA测定DA、5-HT水平;透射电镜观察海马组织超微结构及自噬变化;Nissl染色观察海马CA1区神经元形态变化;免疫组化检测BDNF表达;Western blot检测AMPK、p-AMPK、mTOR、p-mTOR、P62和Beclin-1表达。结果:与Control组相比,Model组神经元排列稀疏,伴有神经元丢失及炎性细胞浸润,细胞间隙增宽,尼氏体颗粒减少,着色变浅,线粒体及神经元胞质肿胀严重,线粒体边界模糊,内质网和高尔基体扩张,自噬囊泡数量减少,糖水偏好、站立时间、移动距离、DA和5-HT水平、BDNF光密度值及Beclin-1和p-AMPK/AMPK表达显著减少,静止时间及P62和p-mTOR/mTOR表达显著增加(P<0.05);与Model组相比,Wog-L组、Wog-M组和Wog-H组神经元形态明显改善,糖水偏好、站立时间、移动距离、DA和5-HT水平、BDNF光密度值及Beclin-1和p-AMPK/AMPK表达显著增加,静止时间及P62和p-mTOR/mTOR表达显著减少(P<0.05)。Compound C逆转了汉黄芩素对抑郁症大鼠的改善作用(P<0.05)。结论:汉黄芩素能改善抑郁症大鼠抑郁样行为,其机制可能与调控AMPK/mTOR信号通路,增强自噬有关。

miR-100调节IGF1R/mTOR信号通路对牙周炎牙周膜干细胞增殖和成骨分化的影响

目的:探究MicroRNA-100(miR-100)对牙周炎牙周膜干细胞(PDLSCs)增殖和成骨分化的影响及潜在机制。方法:丝线结扎法构建牙周炎大鼠模型,建模后分为模型组、NC-agomir组、miR-100 agomir组、NC-antagomir组和miR-100 antagomir组(n=10),另取10只大鼠为对照组。体外培养PDLSCs,分为对照组、TNF-α组、miR-100-NC+TNF-α组、miR-100 mimics+TNF-α组、miR-100 inhibitor+TNF-α组、miR-100 mimics+TNF-α+Oe-NC组、miR-100 mimics+TNF-α+Oe-IGF1R组。细胞经相应处理后检测有关因子表达。结果:上调miR-100可显著降低牙周炎大鼠血清TNF-α、IL-6和IL-1β水平和牙周组织IGF1R和mTOR的mRNA水平(P<0.05),减轻牙周组织病变,而下调miR-100表现出相反作用。在PDLSCs中,miR-100过表达可显著抑制IGF1R和mTOR表达,上调Cyclin E1、Cyclin D1及分化相关蛋白八聚体结合转录因子4(Oct4)、性别决定区Y-box2(Sox2)、Runt相关转录因子2(Runx2)表达,促进炎性微环境下PDLSCs增殖和成骨分化(P<0.05);而下调miR-100表现出相反作用;且过表达IGF1R可减弱miR-100过表达对TNF-α诱导的PDLSC增殖和成骨分化的促进作用(P<0.05)。结论:过表达miR-100可能通过抑制IGF1R/mTOR信号通路促进牙周炎PDLSCs的增殖和成骨分化。

铅暴露通过Merlin-mTOR信号通路促脑膜瘤细胞增殖及迁移侵袭

铅(Pb)毒性是影响全球数百万人的公共卫生问题,临床研究发现脑膜瘤的重要危险因素是铅暴露。同时在脑膜瘤患者体内常能发现由NF2基因编码的Merlin蛋白缺失。但是铅暴露如何调节脑膜瘤细胞的发生发展目前研究仍无定论。本研究旨在分析铅暴露对脑膜瘤细胞的增殖、细胞体积、迁移侵袭能力的影响以及其潜在分子机制。结果显示,醋酸铅可抑制脑膜瘤细胞IOMM-Lee的Merlin蛋白表达、促进细胞的增殖和迁移侵袭能力、mTOR分子磷酸化增加,而Merlin蛋白外源过表达则可逆转醋酸铅介导的细胞增殖迁移侵袭能力增加、 mTOR磷酸化分子增加。该结果提示,铅暴露可通过Merlin-mTOR信号通路促进脑膜瘤细胞IOMM-Lee的增殖和迁移侵袭。

哺乳动物Ste20样激酶1在糖尿病心肌病发病中的作用机制研究进展

糖尿病心肌病(diabetic cardiomyopathy,DCM)是一种严重不可逆的心血管并发症,其临床表现主要为左心室肥厚、心肌纤维化和舒张功能受损。研究显示,线粒体过度分裂、自噬紊乱、细胞凋亡、氧化应激、炎症反应和心肌纤维化等均参与糖尿病心肌病的发病。近年来,有研究表明,哺乳动物Ste20样激酶1(Mst1)可能与糖尿病心肌病的发生和发展密切相关。本文主要围绕Mst1在糖尿病心肌病发展中的作用进行论述。

哺乳动物不育系20样激酶1在代谢性疾病中的研究进展

哺乳动物不育系20样激酶1(MST1)是Hippo信号通路的核心组件,在进化中高度保守,最初研究证实MST1在肿瘤的发展进程中起重要作用,随着对其深入研究,发现MST1在肝脏细胞、胰岛β细胞、肿瘤细胞、骨细胞等人体多种细胞系广泛表达,并在代谢调节、维持代谢稳态中发挥关键作用,参与多种代谢性疾病的发生。本文就MST1在代谢性疾病中的最新研究进展进行综述,以期为代谢相关性疾病的研究和治疗提供理论基础及可能的思路和策略。

Hippo通路蛋白在凝血酶活化的血小板中激活并调控体外血小板活化

目的:探讨Hippo通路蛋白在凝血酶刺激的血小板中的磷酸化水平,并探索其对血小板活化的影响。方法:免疫印迹法检测凝血酶活化的人血小板中Hippo通路蛋白—哺乳动物STE20样激酶1/2(MST1/2)、核Dbf2相关激酶1/2(NDR1/2)和MOB1的磷酸化水平;血小板聚集仪检测MST1/2抑制剂XMU-MP-1对血小板聚集的影响;流式细胞仪检测XMU-MP-1对血小板整合素αIIbβ3活化和CD62p表达的影响;血块回缩实验检测XMU-MP-1对血小板整合素“outside-in”信号的影响;免疫印迹法检测XMU-MP-1对血小板Hippo通路蛋白和p38磷酸化水平的影响。结果:MST1/2、NDR1/2和MOB1的磷酸化水平在凝血酶活化的血小板中显著升高(P<0.05);XMU-MP-1可抑制凝血酶诱导的血小板聚集和αIIbβ3活化(P<0.05),但不影响α颗粒释放和血块回缩;在XMU-MP-1处理的血小板中,凝血酶诱导的Hippo蛋白的磷酸化水平下降(P<0.05),而p38的磷酸化不受影响。结论:Hippo通路蛋白在凝血酶诱导的血小板中被激活,并参与血小板活化调控。

17例原发性肺黏液表皮样癌的病理分析与文献复习

目的 探讨原发性肺黏液表皮样癌的组织病理、临床特征及CRTC1/3-MAML2融合基因的情况。方法 回顾分析2019-2021年中国科学技术大学附属第一医院17例原发性肺黏液表皮样癌,并对其临床信息、病理组织学形态、免疫组化及CRTC1/3-MAML2融合基因进行检测。结果 患者平均年龄为51.3±17.3岁。男女人数比例相仿。瘤体大小为3~97mm(平均值为27.4±22.6mm)。左右肺发病比例相仿。低级别黏液表皮样癌14例(82.4%),高级别黏液表皮样癌3例(17.6%)。免疫组化中,CK7和CK5/6表达率均为100%。MAML2基因重排与患者的年龄、性别、瘤体直径、部位及病理分化程度均无显著相关性(P>0.05)。结论 CRTC1/3-MAML2融合基因重排在黏液表皮样癌中的发生率高,因此MAML2基因重排可以成为原发性肺黏液表皮样癌的分子辅助诊断指标之一。

Hippo信号通路在缺血再灌注损伤中的研究进展

Hippo信号通路是一条进化保守,可调节器官大小和细胞迁移、分化、增殖和凋亡的信号通路。在哺乳动物体内,Hippo通路通过多种保守激酶相互作用来调节器官大小和细胞迁移、分化、增殖和凋亡。研究发现,Hippo通路与缺血再灌注(Ischemia/Reperfusion,I/R)损伤密切相关,其核心组分哺乳动物Ste20样激酶1/2(Mammalian STE20-like kinase 1/2,Mst1/2)和Yes相关蛋白(Yes-associated protein,YAP)介导氧化应激、血脑屏障损伤、胶质细胞活化等过程,与线粒体动力学、细胞凋亡及瘢痕形成等紧密相关,参与I/R损伤的发生发展。因此,Mst1/2和YAP有望成为治疗I/R损伤的新靶点。本文以Mst1/2和YAP蛋白为研究核心,分别梳理Mst1/2和YAP蛋白在I/R损伤中的作用机制,为I/R损伤治疗寻找新思路。

梓醇对氧糖剥夺/复氧复糖损伤成熟人神经母细胞瘤细胞的修复作用及其机制

目的观察梓醇对氧糖剥夺/复氧复糖损伤的人神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y(SH-SY5Y细胞)的修复作用,并探讨其作用机制。方法将SH-SY5Y细胞分为对照组、诱导组、模型组、梓醇组。对照组:SH-SY5Y细胞不做任何处理;诱导组:用ATRA诱导SH-SY5Y细胞72 h,将其诱导为成熟神经元;模型组:ATRA诱导SH-SY5Y细胞72 h后,将完全培养基换成无糖的EBSS溶液置于三气培养箱(氧气1%,二氧化碳5%,氮气94%)4 h,氧糖剥夺结束后换回完全培养基(含糖),复氧12 h;梓醇组:细胞经模型组同样处理后,加入含不同浓度梓醇(50、100、200μmol/L)的完全培养基常规培养72 h。采用CCK-8法检测各组细胞的活力;细胞划痕实验观察细胞的迁移、穿越能力;β-Ⅲ-tubulin免疫荧光染色标记轴突,并测量其长度;Western blotting法检测细胞中神经生长相关蛋白(GAP43)、骨桥蛋白(OPN)、磷酸化的胰岛素生长因子1受体(p-IGFR)、抑癌基因(PTEN)、雷帕霉素分子靶点(mTOR)、磷酸化核糖体S6蛋白(p-S6)。结果与对照组相比,诱导组存活率升高(P<0.0001);与诱导组相比,模型组存活率降低(P<0.0001);不同浓度梓醇组存活率均有升高(P均<0.05),各浓度组之间比较,P>0.05。对照组细胞胞体圆润,轴突较短,胞体与胞体之间几乎没有轴突连接;诱导组细胞轴突较长并且相互交织,形成神经网络;与诱导组相比,模型组数量减少,胞体扁平,轴突回缩;与模型组比较,梓醇组神经元数量增多,轴突长度获得一定的恢复;与空白对照组相比,诱导组轴突长度延长;与诱导组相比,模型组轴突长度缩短(P<0.001);不同浓度梓醇组神经元轴突长度均延长(P均<0.01),而不同浓度梓醇组之间比较,P>0.05。与模型组相比,不同浓度梓醇组48 h后的划痕面积均小(P均<0.05),不同浓度梓醇组之间比较,P>0.05。与诱导组比较,模型组PTEN相对表达量升高(P<0.05),OPN降低(P<0.05);与模型组比较,不同浓度梓醇组GAP43、OPN、p-IGFR、mTOR及p-S6蛋白相对表达量均升高,PTEN蛋白相对表达量降低(P均<0.05)。结论梓醇对氧糖剥夺/复氧复糖损伤的SH-SY5Y细胞具有修复作用,其作用机制可能是通过上调OPN表达,诱导细胞表面IGFR受体磷酸化成为p-IGFR,进而激活mTOR通路,同时降低PTEN的表达以减轻其对mTOR通路的抑制作用,使细胞内在生长能力被充分启动,从而达到促进神经细胞迁移、轴突发芽和生长的作用。50、100、200μmol/L梓醇对氧糖剥夺/复氧复糖损伤的SH-SY5Y细胞修复作用相当。

巨噬细胞特异性敲除MST1小鼠模型的构建

目的制备髓系(包括巨噬细胞和粒细胞)特异敲除哺乳动物不育系20样激酶1(MST1)基因小鼠,为研究巨噬细胞MST1在临床相关疾病发生中的作用及机制提供动物模型。方法利用MST1基因携带loxP位点的小鼠(Mst1^(flox/flox))和髓系细胞特异表达LysM-Cre小鼠杂交构建巨噬细胞特异性敲除MST1小鼠(Mst1^(flox/flox)LysM-Cre^(+),即Mst1^(ΔM/ΔM));通过聚合酶链式反应(PCR)分别扩增loxP位点和Cre基因进行基因型鉴定;通过定量PCR以及免疫荧光验证MST1在巨噬细胞中的敲除效率;通过流式细胞术检测肝脏主要免疫细胞群。结果Mst1^(flox/flox)LysM-Cre^(+),即Mst1^(ΔM/ΔM)为巨噬细胞特异性敲除MST1小鼠基因型;qPCR和免疫荧光检测表明骨髓来源的巨噬细胞和腹腔巨噬细胞的MST1敲除效率达70%以上;流式检测表明敲除巨噬细胞MST1基因对小鼠肝脏的主要免疫细胞群无明显影响。结论成功构建巨噬细胞特异敲除MST1小鼠模型,为进一步研究巨噬细胞MST1在临床相关疾病中的作用及机制奠定了基础。

白桦脂酸调节AMPK/mTOR/ULK1信号通路对冠心病大鼠血管平滑肌细胞自噬和凋亡的影响

目的探究白桦脂酸通过调节腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)/Unc-51样自噬激活激酶1(ULK1)信号通路对冠心病大鼠血管平滑肌细胞自噬和凋亡的影响。方法原代培养冠心病大鼠血管平滑肌细胞,将其随机分为正常组(Control组)、模型组(Model组)、低浓度(20μmol/L)白桦脂酸组(BA-L组)、高浓度(40μmol/L)白桦脂酸组(BA-H组)和高浓度(40μmol/L)白桦脂酸+AMPK抑制剂(10μmol/L)Compound C组(BA-H+CC组)。CCK-8法检测大鼠血管平滑肌细胞的细胞活力。流式细胞术检测细胞凋亡。mRFP-GFP-LC3双荧光体系示踪大鼠血管平滑肌细胞的自噬小体。实时荧光定量PCR(RT-qPCR)实验检测大鼠血管平滑肌细胞中AMPK、mTOR、ULK1 mRNA的表达。Western blot实验检测大鼠血管平滑肌细胞中AMPK、mTOR、ULK1、LC3、Bax、Bcl-2、Beclin-1蛋白表达水平。结果与Control组相比,Model组血管平滑肌细胞的细胞活力(48 h、72 h)、Bcl-2蛋白表达、mTOR mRNA和蛋白表达显著上升(P<0.05),细胞凋亡率、Bax、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin-1蛋白表达、AMPK及ULK1 mRNA和蛋白表达显著下降(P<0.05)。与Model组相比,BA-H组血管平滑肌细胞的细胞活力(48 h、72 h)、Bcl-2蛋白表达、mTOR mRNA和蛋白表达显著下降(P<0.05),细胞凋亡率、Bax、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin-1蛋白表达、AMPK及ULK1 mRNA和蛋白表达显著上升(P<0.05)。Compound C减弱了白桦脂酸对血管平滑肌细胞自噬和凋亡的促进作用(P<0.05)。结论白桦脂酸可能通过激活AMPK/mTOR/ULK1信号通路促进冠心病大鼠血管平滑肌细胞的自噬和凋亡。

沉默CDKL1基因通过调控PTEN/Akt/mTOR信号通路对乳腺癌MCF-7细胞增殖和侵袭的抑制作用

目的:探讨细胞周期蛋白依赖性蛋白样激酶1(CDKL1)基因沉默对乳腺癌MCF-7细胞增殖、侵袭和转移的影响,并阐明其可能的作用机制。方法:选择乳腺癌MCF-7细胞作为研究对象,采用小干扰RNA技术(siRNA)沉默CDKL1基因表达。采用1μmol·L^(-1)磷酸酶和张力蛋白同源物(PTEN)抑制剂BpV或10μmol·L^(-1)蛋白激酶B(Akt)激动剂SC79进行干预。取对数生长期MCF-7细胞,分为空白对照组(MCF-7细胞不作任何处理)、转染对照(siRNA-NC)组(MCF-7细胞转染siRNA-NC质粒)、siRNA-CDKL1组(MCF-7细胞转染siRNA-CDKL1质粒)、siRNA-CDKL1+PTEN抑制剂BpV(siRNA-CDKL1+BpV)组(转染siRNA-CDKL1的MCF-7细胞,再采用1μmol·L^(-1)PTEN抑制剂BpV处理2h)和siRNA-CDKL1+Akt激动剂SC79(siRNA-CDKL1+SC79)组(转染siRNA CDKL1的MCF-7细胞,再采用10μmol·L^(-1)Akt激动剂SC79处理2 h)。采用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)和Western blotting法检测各组乳腺癌MCF-7细胞中CDKL1 mRNA和蛋白表达水平,CCK-8法检测各组乳腺癌MCF-7细胞增殖活性,EdU法检测各组乳腺癌MCF-7细胞中EdU阳性细胞率,细胞划痕愈合实验检测各组乳腺癌MCF-7细胞划痕愈合率,Transwell小室实验检测各组乳腺癌MCF-7细胞的迁移和侵袭细胞数,Western blotting法检测各组乳腺癌MCF-7细胞中基质金属蛋白酶2(MMP-2)、基质金属蛋白酶9(MMP-9)、PTEN、Akt、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)、磷酸化Akt(p-Akt)和磷酸化mTOR(p-mTOR)蛋白表达水平。结果:与siRNANC组比较,siRNA-CDKL1组乳腺癌MCF-7细胞中CDKL1 mRNA和蛋白表达水平降低(P<0.01),细胞增殖活性降低(P<0.01),EdU阳性细胞率降低(P<0.01),乳腺癌MCF-7细胞迁移和侵袭细胞数降低(P<0.01),细胞中MMP-2、MMP-9、p-Akt和p-mTOR蛋白表达水平降低(P<0.01),PTEN蛋白表达水平升高(P<0.01)。与siRNA-CDKL1组比较,siRNA-CDKL1+BpV组和siRNACDKL1+SC79组乳腺癌MCF-7细胞增殖活性升高(P<0.01),EdU阳性细胞率升高(P<0.01),迁移和侵袭细胞数增加(P<0.01),细胞中MMP-2、MMP-9、p-Akt和p-mTOR蛋白表达水平升高(P<0.01),PTEN蛋白表达水平降低(P<0.01)。结论:CDKL1基因的沉默可以抑制乳腺癌MCF-7细胞的增殖、侵袭和转移能力,其作用机制可能与调控PTEN/Akt/mTOR信号通路有关。

蛋白hSav1和Mst1之间的相互作用

目的探讨hSav1(human salvador1)和Mst1(Mammalian STE20-like 1)存在的相互作用,为进一步研究Mst1的功能及相关机制奠定基础。方法以Mst1cDNA全长构建诱饵蛋白载体pGBKT7-Mst1,并对其自身转录活性进行鉴定,利用酵母双杂交系统筛选人胎肝文库,挑选单克隆,从而初步筛选出与Mst1相互作用的蛋白。然后构建初步筛选出的蛋白hSav1的载体pCMV-HA-hSav1,与蛋白Mst1的载体pcDNA/4TO-Flag-Mst1共转染HEK293T细胞,利用相应抗体做二者的免疫共沉淀,以验证蛋白hSav1和Mst1之间的相互作用。其次构建pEGFP-hSav1质粒转染HEK293T,利用免疫荧光观察二者在细胞内的定位。结果以Mst1为诱饵蛋白在人胎肝文库筛选到包括hSav1在内的与之存在相互作用的蛋白。免疫共沉淀结果显示,hSav1蛋白可以在FLAG抗体的免疫沉淀物中检测出来,同样在hSav1抗体的免疫沉淀物中也能检测到蛋白Mst1。免疫荧光的结果显示二者荧光在细胞内存在共定位,二者的荧光可充分融合。结论蛋白hSav1与Mst1在哺乳细胞内存在某种相互作用,为进一步研究Mst1的功能及相关机制提供了线索。

Mst1对结直肠癌SW480细胞增殖与凋亡的影响

MST1是死亡受体信号通路Hippo通路的核心成员,其基因表达异常多见于结直肠癌、肝癌、胃癌等肿瘤。为了探讨MST1表达对人结直肠癌SW480细胞增殖与凋亡的影响及其发生机制,采用PolyJet TM介导pEGFP-N1-Mst1及LipofectamineTM2000介导Mst1特异性-siRNA转染至SW480细胞,分别建立高低表达Mst1的细胞模型。对不同分组的细胞增殖、凋亡及凋亡相关蛋白的表达进行检测。结果显示,Mst1高表达组细胞增殖抑制、凋亡率及凋亡相关蛋白的表达显著增高,反之,Mst1低表达组细胞增殖加快,细胞凋亡率及凋亡相关蛋白的表达显著降低。结果提示,Mst1的靶向调控能较好地控制结直肠癌细胞的增殖与凋亡,可作为人结直肠癌防治的新研究靶点。

喉癌组织中Mst1基因表达与喉癌的相关性及其对人Hep2细胞化疗敏感性的影响

目的探讨Mst1基因在喉癌发生、发展中的作用,并指导化疗用药。方法荧光定量PCR法检测74例喉癌及相应癌旁组织中Mst1 mRNA表达;实验分为实验组、空白对照组和阴性对照组,实验组转染真核表达载体pcDNA3.1-Mst1,空白对照组未转染,阴性对照组转染空载体。Western blot法检测三组Mst1蛋白表达。三组细胞培养基中分别加入0、1、3、5μg/ml顺铂(DDP)进行干预,作用12 h,MTT法测定三组细胞增殖活力,流式细胞仪检测细胞凋亡率。结果喉癌组织中Mst1 mRNA表达明显低于癌旁组织;实验组Mst1蛋白表达、细胞凋亡率明显高于空白对照组及阴性对照组,细胞增殖活力明显低于空白对照组及阴性对照组;DDP干预后,随DDP浓度增加,实验组细胞凋亡率明显升高,增殖活力明显降低。结论喉癌发生与Mst1 mRNA表达降低相关,Mst1蛋白表达增加能抑制Hep2细胞增殖并促进凋亡,并可在一定程度上增强肿瘤细胞对DDP的敏感性,可将Mst1基因作为指导喉癌化疗用药的参考指标。