鸡毒支原体 Taq Man实时荧光定量PCR检测方法的建立

为快速检测鸡毒支原体,根据鸡毒支原体的保守基因设计特异性引物和Taq Man探针,建立鸡毒支原体Taq Man实时荧光定量PCR方法并分析鸡毒支原体培养过程中颜色单位改变法(color change unit,CCU)和荧光定量PCR检测的相关性。结果显示,标准曲线y=-3.646x+44.208,相关系数R^(2)=0.998,最低检测限度为1 copy/μL;与其他菌株等均无交叉反应;组内和组间变异系数均小于3%,表明该方法具有良好的稳定性和可重复性。用建立的实时荧光定量PCR检测方法对26份临床样品进行检测,该方法较普通PCR方法检出率更高。建立的荧光定量PCR与CCU显示鸡毒支原体在对数生长期时,两者具有一定的对应关系。表明建立了鸡毒支原体Taq Man探针实时荧光定量PCR检测方法,可实现对鸡毒支原体的快速检测,为鸡毒支原体感染的防控提供技术基础。

羊贝氏柯克斯体TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立及应用

为建立检测贝氏柯克斯体(Coxiella burnetii)实时荧光定量PCR方法,根据GenBank上收录的C.burnetii RSA439株com1基因序列(CP040059.1)保守区设计特异性引物和探针,并构建重组质粒及优化反应条件,以期建立一种检测贝氏柯克斯体的Taq Man荧光定量PCR方法。结果显示,该方法所建立标准曲线线性关系良好;敏感性试验结果显示,最低检出限为2.45×10^(2) copies/μL,与PCR最低检出限为2.45×10^(4) copies/μL相比较,灵敏度提高了100倍;对羊支原体、羊流产衣原体、羊布鲁氏菌等均无交叉反应,批内和批间重复性试验结果稳定,变异系数均小于3%,说明特异性、重复性好;利用该方法对收集的126份样品进行检测,结果显示样品阳性率为9.52%,常规PCR检测阳性率为7.14%,符合率为90.47%。该方法可为贝氏柯克斯体临床上快速检测及防控提供技术支持。

荧光定量PCR探针熔解曲线法在结核分枝杆菌耐药基因检测中的应用研究

探讨在结核分枝杆菌耐药基因检测中,对其予以荧光定量PCR探针熔解曲线法,观察分析应用价值。方法 本研究的时长段在2022年6月到2023年6月,统共1000例结核患者接受治疗,所有病患都拓展了抗结核药物的测验,且每一位患者的标本均予以荧光定量PCR探针熔解曲线法检测,药物敏感性测定结果为黄金基准,考察判辨荧光定量PCR探针熔解曲线法对利福平医药品、异烟肼医药品、乙胺丁醇医药品、链霉素医药品的诊断效能。结果 针对1000例的标本中,经过液体药敏试验检测显示对利福平药物耐药例数250例,役使溶解曲线观察耐药性包含了240例患者;对异烟肼医药有耐药性的液体药敏试验500例,应用溶解曲线检测耐药性包含了470例;经过液体药敏试验检测显示对乙胺丁醇药物耐药例数170例,予以熔解曲线法显示耐药140例。经过液体药敏试验检测显示对乙胺丁醇药物耐药例数300例,役使溶解曲线观察耐药性包含了240例患者。熔解曲线法对利福平医药品、异烟肼医药品、乙胺丁醇医药品、链霉素医药品的灵敏度分别为84.00%、84.00%、47.06%、66.67%;特异度分别为96.00%、90.00%、84.34%、94.29%;准确度分别为93.00%、97.00%、91.00%、86.00%。结论 在结核分枝杆菌耐药基因检测中,对其予以荧光定量PCR探针熔解曲线法,可得到较高的应用价值,灵敏度、特异度、准确度较高,可筛查结核病患者对利福平、异烟肼、乙胺丁醇等药物的耐药性,为临床治疗疾病提供可靠的依据。

猫冠状病毒荧光定量PCR检测方法的建立

猫冠状病毒(FCoV)在全球猫种群中广泛流行,隐形感染的猫导致病毒在猫群中持续传播。提高样本检测率、早预防、早治疗可减少种群中病毒流行率。为建立可以灵敏、准确检测FCoV的Taq Man荧光定量PCR检测方法,根据GenBank公布的FCoV基因片段N保守区域设计了1对特异性引物和1条探针,通过优化反应体系,建立了FCoV Taq Man荧光定量PCR检测方法,对75份临床样品进行检测。结果表明,该方法在1.49×10^(11)~1.49×10^(2) copies/μL之间具有良好的线性关系,特异性强,敏感性高,对FCoV质粒标准品最低检测下限为1.49×10^(0) copies/μL,而普通PCR对FCoV质粒标准品最低检测下限为1.49×10^(5) copies/μL;重复性好,组内变异系数和组间变异系数均小于3%;75份临床样品,阳性率为37.33%。研究建立的FCoV检测方法扩增效率高、特异性强、敏感性好、稳定性高,且实用性好,可以用于FCoV的快速检测,可为流行病学调查提供有效的技术手段。

猪肺炎支原体实时荧光定量PCR检测方法建立及应用

猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae)是一种严重危害养猪业的重要传染性病原,以猪肺炎支原体编码乳酸脱氢酶的P 36基因保守序列为基础,设计一套特异性引物和探针,并通过优化筛选反应条件,建立了一种Mhp的实时荧光定量RT-PCR检测方法。结果表明,最适引物浓度为10μmol/L,探针浓度为5μmol/L,以浓度为1×10^(2)~1×10^(6)copies/μL的标准品构建标准曲线相关系数为0.998,扩增效率可达96%。该方法能特异地检测猪肺炎支原体,与其他动物支原体及猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪圆环病毒2型、猪瘟病毒、伪狂犬病病毒等病原无交叉反应;灵敏度是常规PCR的10倍,可达到10拷贝;该方法重复性较好,组内和组间变异系数均小于2%。在对30份临床样本的检测中,建立的实时荧光定量PCR检出率为63%(19/30),而常规PCR的检出率仅有30%(9/30)。结果表明,成功建立了猪肺炎支原体实时荧光定量PCR检测方法,可用于猪肺炎支原体的病原学检测和流行病学调查。

鸡贫血病毒Taq Man探针荧光定量PCR检测方法的建立

根据鸡贫血病毒(CAV)的基因序列,选取一段高度保守的基因序列作为目的片段设计引物与探针,将该目的片段克隆到pMD18-T载体中,作为阳性标准品。通过优化荧光定量PCR反应条件,建立了CAV的荧光定量PCR检测方法。结果表明,该检测方法的敏感性达到10个病毒拷贝/μL,与其他禽病病毒无交叉反应,批间与批内重复试验相关系数都小于5%。实验数据证明该检测方法敏感性高,特异性好,重复性佳。

基于Taq Man探针的猪繁殖与呼吸综合征病毒荧光定量PCR检测方法的研究

通过条件优化,以定量的10倍系列稀释的质粒pMD-ORF7为标准品进行荧光定量PCR扩增并制作标准曲线建立了PRRSV的荧光定量RT-PCR检测方法。结果表明,该方法检测灵敏度可达1.0×100拷贝/μL;用该方法对6份不同的组织样品进行重复性检测,结果显示具有良好的重复性和重现性。对阳性组织病料的检测表明该方法与常规RT-PCR阳性符合率为100%,但检测灵敏度高出常规RT-PCR 100倍。

TaqMan探针法实时荧光定量PCR检测西瓜潜隐病毒

【目的】西瓜潜隐病毒(Citrullus lanatus cryptic virus,CiLCV)是近年来新发生的一种重要种传病害,研究旨在建立基于TaqMan探针法的实时荧光定量PCR(real-time fluorescent quantitative PCR with TaqMan probes,TaqMan-qPCR)检测技术,为开展种子、种苗带毒鉴定和病害防控提供技术支撑。【方法】通过基于小RNA高通量测序技术在北京西瓜产地发现了CiLCV,并克隆CiLCV的dsRNA1和dsRNA2全长序列,设计特异性引物建立RT-PCR和TaqMan-qPCR检测方法。以黄瓜绿斑驳花叶病毒(cucumber green mottled mosaic virus)、黄瓜花叶病毒(cucumber mosaic virus)、甜瓜内源病毒(Cucumis melo endornavirus)、瓜类褪绿病毒(cucurbit chlorotic yellows virus)、南瓜花叶病毒(squash mosaic virus)、番茄斑萎病毒(tomato spotted wilt virus)、西瓜花叶病毒(watermelon mosaic virus)、小西葫芦黄花叶病毒(zucchini yellow mosaic virus)8种常见病毒为对照进行检测方法特异性分析;利用建立的实时荧光定量标准曲线对方法灵敏度进行评价;进一步利用TaqMan-qPCR和RT-PCR技术监测我国葫芦科作物主产区的西瓜、黄瓜、甜瓜和南瓜(砧木)种苗带毒情况。【结果】通过分析获得的高质量小RNA数据,发现17条组装的contig与CiLCV基因组有较好同源性。进一步克隆获得CiLCV的dsRNA1和dsRNA2序列全长(分别为1603和1466 nt),发现其与河南省鉴定出的CiLCV同源性高达99.4%和99.8%(GenBank number KY081285、KY081284)。建立的RT-PCR检测技术对CiLCV有单一扩增条带;建立的TaqMan-qPCR检测技术具有较好特异性和灵敏度,且能够检测到最低拷贝数为2×10^(3)的病毒,灵敏度是RT-PCR的100倍。同时,发现有1份来自北京的西瓜种苗检出了CiLCV,而其余地区的西瓜、黄瓜、甜瓜和南瓜(砧木)种苗均未检出该病毒,表明我国葫芦科作物主产区种苗带毒情况总体不高。【结论】建立的TaqMan-qPCR检测CiLCV技术特异性强、灵敏度高,适用于口岸和实验室开展CiLCV快速检测和精准鉴定。鉴于CiLCV可以通过种子、种苗等传播方式快速扩散,我国应重视种子、种苗的带毒检测,防止带毒种子、种苗流入生产环节进而调运扩散至全国,给产业造成重大经济损失。

超级细菌bla_(NDM-1)基因TaqMan-MGB荧光定量PCR检测方法的建立

为建立快速检测超级细菌编码新德里金属β-内酰胺酶1(NDM-1)的bla_(NDM-1)基因的方法,本研究针根据bla_(NDM-1)及其变异体的基因序列设计一对特异性引物和一条MGB探针,以构建的含有bla_(NDM-1)基因片段的重组质粒作为阳性标准品,经条件优化,建立了检测bla_(NDM-1)基因的TaqMan-MGB荧光定量PCR方法。结果显示该方法可以特异性扩增bla_(NDM-1)基因重组质粒标准品,而对鸡白痢沙门氏菌、大肠杆菌、多杀性巴氏杆菌和鼠伤寒沙门氏菌的标准菌株扩增均为阴性;检出下限为2.59拷贝/μL,比常规PCR敏感性高100倍;组内及组间重复性试验的变异系数均小于1.5%。利用所建立的方法对34株鸡源致病性沙门氏菌分离株进行检测,结果均未检测到目的片段,表明所有分离株均未携带bla_(NDM-1)基因。本研究建立的TaqMan-MGB荧光定量PCR方法特异性强、敏感性高、重复性好,可用于监测携带bla_(NDM-1)基因及其变异体的超级细菌。

基因Ⅱ型草鱼呼肠孤病毒TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立与应用

基因Ⅱ型草鱼呼肠孤病毒(GCRV-Ⅱ)是当前引起草鱼出血病暴发与流行的主要病原,为建立快速检测GCRV-Ⅱ的方法,本研究根据GCRV-ⅡRd Rp基因的保守区域序列设计引物及TaqMan探针,经反应参数优化,建立了检测GCRV-Ⅱ的荧光定量PCR方法。结果显示,该方法仅对GCRV-Ⅱ的靶基因序列进行扩增,与其它非靶目标核酸均无交叉反应;其最低检出量为3拷贝/μL病毒核酸,比普通PCR的敏感度高100倍;组内和组间重复试验变异系数均小于1%。采用该方法检测60份草鱼出血病疑似样品,GCRV-Ⅱ阳性检出率为75%(45/60),与细胞分离结果一致。应用该方法分析了GCRV-Ⅱ在不同细胞和不同培养方式下病毒的增殖含量,结果显示GSB和PSF细胞增殖量最大,达106拷贝/μL^107拷贝/μL病毒核酸,转瓶接种比常规的细胞培养瓶和培养板接种其病毒含量低2个数量级。本研究建立的GCRV-ⅡTaqMan荧光定量PCR方法具有高效、特异、敏感、可重复性强的优点,适用于GCRV-Ⅱ的临床快速检测和病毒定量分析。

Taqman实时荧光定量PCR快速检测白斑综合症病毒的方法研究

目的:建立一种快速、特异、灵敏的实时荧光定量PCR方法用于检测白斑综合病毒DNA,为控制对虾白斑综合症提供科学依据。方法:根据GenBank登录的白斑综合病毒株序列,使用生物学软件进行序列对比,在白斑综合症病毒保守区序列设计引物和Tagman探针并进行筛选。对实时荧光定量PCR反应条件进行优化,提高了该方法的特异性、灵敏度和重现性等,并与标准方法(核酸探针点杂交)进行比对,对现场32份虾样进行了检测。结果:Tagman实时荧光定量PCR与标准方法的特异性符合率为100%,灵敏度超过标准方法的10000～100000倍,检测时间为标准方法的1/24,重现性良好(s=0.1～0.49,CV=0.78%～3.72%),并能准确定量。结论:本研究建立的Taqman实时荧光定量PCR方法用于白斑综合症病毒检测具有特异、灵敏、快速、定量、重现性好等优点。

鸭瘟病毒TaqMan实时荧光定量PCR方法的建立

根据鸭瘟病毒(DEV) gE基因的特征,设计特异性引物和探针,经条件优化后,建立检测DEV的TaqMan实时荧光定量PCR方法.结果表明:当gE基因含量为1.0×10~1～1.0×10~6拷贝·μL^(-1)时,建立的实时荧光定量PCR检测方法有良好的线性扩增,其标准曲线方程为:y=-3.480x+37.955,扩增相关系数为0.999;敏感性强,最低检测限为10拷贝·μL^(-1);特异性好,仅对DEV强毒株和弱毒活疫苗株检测到阳性扩增信号,对鸭源其他传染病病原(番鸭细小病毒、鹅细小病毒、鸭腺病毒A型、鸭甲肝病毒1型、鸭甲肝病毒3型、番鸭呼肠孤病毒、新型鸭呼肠孤病毒、H9N2亚型禽流感病毒、禽1型副粘病毒、鸭源大肠杆菌、鸭疫里默氏杆菌、鸭源禽多杀性巴氏杆菌)检测均为阴性;重复性好,组内变异系数和组间变异系数分别为0.62%～1.14%和0.69%～2.40%.对临床送检疑似DEV感染的14份样品进行检测,并与常规PCR方法、病毒分离鉴定进行比较,阳性率分别为85.71%(12/14)、71.43%(10/14)和57.14%(8/14);且与常规PCR方法、病毒分离鉴定的阳性符合率均为100%.本试验建立的TaqMan实时荧光定量PCR方法,可用于开发DEV快速诊断试剂盒,用于开展DEV流行病学调查.

基于实时荧光定量PCR的番木瓜多重PCR高效检测方法

以pCaMV35S基因核酸检测试剂盒反应体系为基础,添加多重PCR反应所需的目标基因引物和番木瓜(Carica papaya L.)DNA,进行多重PCR反应,同时考察不合成荧光探针的情况下对目标基因进行实时荧光定量检测。结果表明,在实时荧光定量PCR反应体系中,多重PCR扩增的基因条带比常规PCR扩增的基因条带更亮,在不合成荧光探针的情况下实现目标基因的实时荧光定量PCR反应,以期建立一种基于实时荧光定量PCR的多重PCR检测方法。

鸭腺病毒A型TaqMan实时荧光定量PCR检测方法的建立

试验旨在建立鸭腺病毒A型(duck adenovirus A,DAdV-A)TaqMan实时荧光定量PCR检测方法。根据DAdV-A Hexon基因序列设计特异性引物和探针,建立了基于TaqMan探针检测DAdV-A的实时荧光定量PCR检测方法,对其特异性、灵敏性、重复性进行检测,用建立的TaqMan实时荧光定量PCR检测方法和常规PCR方法同时对福建地区临床收集的85份番鸭源病料进行DAdV-A感染的检测,比较其符合率。结果表明,试验成功建立了检测DAdV-A的实时荧光定量PCR检测方法,其扩增相关系数为0.996,扩增效率为99.9%;特异性强,对鸭常见病原(如鸭瘟病毒、鹅细小病毒、番鸭细小病毒、鸭圆环病毒、鸭源大肠杆菌、鸭疫里默氏杆菌和鸭源禽多杀性巴氏杆菌)检测均为阴性;灵敏度高,最低检测限为8.37拷贝/μL;重复性好,组内变异系数和组间变异系数分别为0.54%~1.28%和0.61%~2.39%。对临床送检的85份病料,TaqMan实时荧光定量PCR方法的阳性率为7.06%(6/85),PCR方法的阳性率为5.88%(5/85),且PCR检测的阳性样品经TaqMan实时荧光定量PCR方法检测均为阳性,符合率为100%。本研究建立了基于TaqMan探针检测DAdV-A的实时荧光定量PCR检测方法,为鸭群中开展DAdV-A的分子流行病学研究提供了有效技术手段。

人类mdr1基因新型Taq Man-MGB探针实时定量PCR检测方法的建立

目的建立一种比现有方法敏感、特异性高、重复性好的实时荧光定量PCR检测的新方法检测人类mdr1基因。方法以含有目的基因mdr1cDNA的质粒pHaMDR1/A为阳性模板,用Primerexpress2.0引物设计软件设计引物和TaqMan-MGB探针,建立荧光定量PCR检测方法。结果当待扩增DNA浓度在3.601×103cps/ml～3.601×109cps/ml范围时,模板浓度与循环阈值(Ct)之间的相关性良好,相关系数r2大于0.98。结论应用TaqMan-MGB探针的实时荧光定量PCR方法检测人类mdr1基因,具有灵敏度高、特异性高和精确度高等优点,可作为进一步研究人类mdr1基因的方法。

牛冠状病毒荧光定量PCR检测方法的建立及初步应用

目的建立特异灵敏的牛冠状病毒(bovine coronavirus,BCV)荧光定量PCR检测方法,并对牛源性样本进行筛查。方法根据Genbank中登录的BCV的N基因序列设计Taq Man引物探针,建立基于Taq Man探针法的BCV PCR检测方法,对收集到的牛源样本进行BCV筛查,并对部分阳性样本的PCR产物进行测序鉴定。结果建立了能够特异检测BCV的Taq Man探针法荧光定量PCR检测方法,其标准曲线相关系数Slope为-3.417,相关系数r2为0.999,,扩增效率Eff为96.195%。该方法检测BCV的敏感度为40 copies。使用该方法检测64份牛肛拭子样本检出率为1.5%,检测33份牛源生物制品检出率为6%,部分阳性样本的PCR产物经测序比对为BCV核酸序列,说明BCV在国内牛群中流行,牛源相关生物制品中有感染BCV的潜在风险。结论经测序验证,建立的方法能够灵敏的检测样本中的BCV核酸,应加强牛源相关生物制品中BCV的监测,避免人感染BCV的潜在风险。

Q热贝纳柯克斯体TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立

根据Q热贝纳柯克斯体(Coxiella burnetii)插入IS1111序列设计引物和探针,建立快速检测Q热的TaqMan实时荧光定量PCR方法。以梯度稀释含有目的扩增片段的重组质粒作为标准品,进行定量PCR反应。结果显示,该方法能够检测出10个拷贝数的阳性质粒;标准曲线相关系数为0.995,扩增效率为103%;结核分枝杆菌(M.tuberculosis)、衣原体(C.psittaci)、布鲁氏菌(Brucella.spp)及牛血液的核酸样本特异性检测结果均为阴性。本研究建立的TaqMan荧光定量PCR法灵敏度高、特异性好,对Q热的检测与鉴定中具有良好的应用前景。

口蹄疫病毒一步法TaqMan-MGB荧光定量RT-PCR检测方法的建立

目的建立一种能快速、高效、敏感、特异地检测口蹄疫病毒（FMDV）的一步法荧光定量RT—PCR检测方法。方法根据FMDV聚合酶3D基因序列比对结果，设计特异性引物和MGB探针；通过优化，得到最佳反应体系和反应条件；分别以质粒和病毒RNA为模板，构建标准曲线；并进行特异性、敏感性、重复性试验。

猪德尔塔冠状病毒TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立及应用

为建立一种快速、灵敏、准确的猪德尔塔冠状病毒(PDCoV)分子检测方法,根据PDCoV M基因的保守序列设计并合成引物和探针,建立了PDCoV M基因Taq Man荧光定量PCR检测方法。结果表明,该方法标准曲线具有良好的线性关系,相关系数为0.998;敏感性好,最低可检测到10 copies/μL的PDCoV M基因标准品;特异性试验结果显示,该方法与猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪轮状病毒(PoRV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪伪狂犬病病毒(PRV)、猪圆环病毒2型(PCV2)、猪细小病毒(PPV)及大肠埃希菌K88菌株均无交叉反应;重复性试验变异系数低于2%,表明重复性良好。对121份临床样本进行检测,阳性检出率为53.7%(65/121),随机选择10份阳性样品的扩增产物进行测序分析,进一步证实扩增产物中含有PDCoV。该方法具有敏感性高、特异性强、用时短和高通量等特点,适用于PDCoV的定量检测与分子流行病学调查,为PDCoV的准确定量及进一步研究奠定了基础。

BVDV 1型和2型TaqMan双重实时荧光定量PCR检测方法的建立

【目的】建立一种快速检测牛病毒性腹泻病毒1型(BVDV1)和2型(BVDV2)的TaqMan双重实时荧光定量PCR方法。【方法】根据GenBank上收录的95株BVDV1和BVDV25′-非编码区设计特异性引物,构建含有BVDV1和BVDV2目的片段的阳性质粒,优化反应条件,构建标准曲线,进行双重实时荧光定量PCR方法的特异性、敏感性和重复性检测,并利用建立的实时荧光定量PCR检测方法对采自吉林省的临床样品进行检测。【结果】建立的双重实时荧光定量PCR方法最适退火温度为57.0℃,最适引物浓度为0.5μmol/L,最适探针浓度为0.3μmol/L,BVDV1和BVDV2型的标准曲线分别为:Y=-3.54X+37.36(R^(2)=0.990)和Y=-3.18X+35.95(R^(2)=0.997)。对牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)、牛呼吸道合胞体病毒(BRSV)和牛副流感病毒3型(BPIV3)均无特异性扩增,批内和批间变异系数均<3%,检测下限为10拷贝/μL。临床样品检测结果显示,总体阳性率为23.1%(36/156),其中BVDV1阳性率为17.9%(28/156),BVDV2阳性率为5.1%(8/156)。【结论】本研究建立了可同时快速、准确鉴别BVDV1和BVDV2的TaqMan双重实时荧光定量PCR方法,为BVDV的防控与净化提供技术支撑。