运用全因子试验方法优化单抗生物类似药生产过程中的糖基化分布

旨在调控单抗生物类似药的糖基化分布,使其与原研药一致。通过全因子设计试验考察不同浓度的半乳糖、尿苷、氯化锰和蛋白水解物对单抗糖基化修饰的影响。结果表明,半乳糖、尿苷及氯化锰均能提高单抗半乳糖基化,且对细胞生长和单抗产量无明显影响。此外尿苷和氯化锰还能降低五聚高甘露糖型(Man5),但过量的尿苷会导致Man5增高。而蛋白水解物除了能降低Man5,提高单抗岩藻糖基化外,对细胞生长也有促进作用。选取模型预测的最优条件进行反应器培养验证,最终的单抗糖基化分布符合预期,成功建立CHO细胞单抗糖基化调控的生产策略。

Man_5GlcNAc_2哺乳动物甘露糖型糖蛋白的毕赤酵母表达系统构建

蛋白的糖基化对蛋白的活性、高级结构及功能都有重要的影响。酵母表达的糖蛋白不同于哺乳动物表达的杂合型或复杂型糖蛋白,而是高甘露糖型或过度甘露糖化糖蛋白。在前期成功敲除毕赤酵母α-1,6-甘露糖转移酶(Och1p)基因、阻断毕赤酵母过度糖基化,获得毕赤酵母过度糖基化缺陷菌株GJK01(ura3、och1)的基础上,通过表达不同物种来源的α-1,2-甘露糖苷酶I(MDSI)的活性区与酵母自身定位信号的融合蛋白,并通过DSA-FACE(基于DNA测序仪的荧光辅助糖电泳)分析筛选报告蛋白HSA/GM-CSF(人血清白蛋白与粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子融合蛋白)的糖基结构,发现当编码酿酒酵母α-1,2-甘露糖苷酶(MnsI)基因的内质网定位信号与带有完整C-端催化区的拟南芥MDSI基因融合表达时,毕赤酵母工程菌株能够合成Man5GlcNAc2哺乳动物甘露糖型糖蛋白。这为在酵母体内合成类似于哺乳动物杂合型或复杂型糖基化修饰的糖蛋白奠定了基础。