manumycin诱导舌鳞癌Tca8113细胞凋亡的作用及机制

目的研究manumycin抑制Tca8113细胞的生长和诱导细胞凋亡的作用及机制。方法细胞毒作用以MTT法测定;凋亡细胞形态以Hoechst33258染色后荧光显微镜观察;凋亡率的检测以AnnexinV染色,流式细胞仪检测;细胞内活性氧(ROS)和线粒体跨膜电位(ΔΨm)分别用DCFH-DA和DiOC6荧光探针标记,流式细胞仪检测;蛋白质定量检测以Westernblot法。结果manumycin浓度依赖性抑制Tca8113细胞的生长,IC50为(11.33±0.63)μmol.L-1;manumycin可浓度和时间依赖性诱导Tca8113细胞的凋亡,过氧化物清除剂N-乙酰半胱氨酸能清除manumycin介导的细胞活性氧的增加,抑制线粒体跨膜电位降低及细胞凋亡。结论manumycin体外显著抑制舌鳞癌Tca8113的生长及诱导细胞凋亡,其机制可能通过激活线粒体依赖性凋亡通路有关。

Manumycin抗人肝癌细胞HepG2裸鼠移植瘤的作用及其对肿瘤血管生成的影响

背景与目的:法尼基转移酶抑制剂manumycin体内外抗胰腺癌、结肠癌和退行性甲状腺癌的研究已见报道。我们先前的体外研究发现,manumycin能抑制人肝癌HepG2细胞的增殖通路和生存通路。本研究拟探讨manumycin在裸小鼠体内的抗肝癌作用及其对肿瘤的血管生成的影响。方法:建立人肝癌HepG2细胞裸鼠移植瘤模型,接种后第8天按肿瘤大小随机分为5组:生理盐水对照组(20ml/kg)、阳性药对照组(CTX,25mg/kg)、0.1%Me2SO阴性对照组(20ml/kg)、manumycin低剂量组(2.5mg/kg)和高剂量组(5mg/kg)。测量各组肿瘤体积观察manumycin的体内抗瘤作用。采用免疫组化方法观察移植瘤的微血管密度(MVD),应用Westernblot法检测VEGF和b鄄FGF的蛋白水平变化,RT鄄PCR法检测VEGFmRNA的水平。结果:manumycin低剂量组和高剂量组的平均肿瘤体积比(V/V0)分别为0.68±0.09和0.59±0.04(n=5),与0.1%Me2SO阴性对照组(V/V0为1.38±0.21)相比,manumycin处理组肿瘤体积明显缩小(P<0.01)。与对照组相比较,manumycin处理组肿瘤组织MVD明显降低(P<0.01)。manumycin能明显抑制HepG2细胞及HepG2细胞裸鼠移植瘤VEGF蛋白的表达,而对b鄄FGF蛋白的表达影响不大。manumycin也明显抑制了HepG2细胞裸小鼠移植瘤VEGFmRNA的表达。结论:manumycin能明显抑制人肝癌HepG2细胞裸小鼠移植瘤的生长。下调VEGF表达,抑制肿瘤的血管生成可能是manumycin抗肿瘤作用的重要机理之一。

Manumycin通过诱导细胞凋亡抑制人胰腺导管癌细胞Panc-1活性

目的:观察manumycin对人胰腺导管癌细胞Panc-1的抑制效应,并探讨其诱导细胞凋亡是否经 p38MAPK介导。方法:用MTT法检测manumycin对Panc-1细胞的抑癌作用。用caspase-3活性检测试剂盒定量检测 manumycin诱导细胞凋亡的水平及评估特异性的p38MAPK抑制剂SB203580对它的影响。结果:经manumycin (6／μmol／L、18／μmol／L、54 μmol／L)处理Panc-1细胞24 h,对Panc-1细胞生长具有明显的抑制作用,其抑制率分别为 8．9％、21．9％和67．0％,其中后二者的细胞活性与对照组相比有显著差异(P<0．01),呈量效关系。用药24 h的IC50 为34．7μmol／L。同时,此药物可明显增加caspase-3的活性,且这一效应可部分地被p38抑制剂SB203580阻断。结 论:Manumycin可通过诱导Panc-1细胞凋亡而产生抑癌作用,p38MAPK是manumycin诱导细胞凋亡的通路之一。

Manumycin与DDP、PYM、5-FU、ADR联合的体外抗舌癌作用

目的:探讨Manumycin(手霉素)与常用舌癌化疗药物顺铂、5-氟脲嘧啶、平阳霉素、阿霉素联合作用于舌鳞癌Tca8113的细胞毒作用。方法:细胞毒测定以MTT法;单药细胞毒测定以半倍浓度梯度设计;联合用药细胞毒测定以ChouTC中效原理设计。结果:Manumycin以及顺铂、5-氟脲嘧啶、平阳霉素、阿霉素单独应用对Tca8113均有明显的细胞毒作用。联合用药显示在相应比例剂量条件下,Manumycin与顺铂联合(3.75:1)后呈拮抗作用,Manumycin与5-氟脲嘧啶联合(0.75:1)作用后,低浓度联合相互拮抗,而高浓度联合时明显协同,Manumycin与平阳霉素(0.75:1)、阿霉素联合(30:1)作用后呈相互协同的作用(CI<1)。结论:Manumycin与平阳霉素、阿霉素以及与5-氟脲嘧啶高浓度联合作用于Tca8113细胞呈相互协同的细胞毒作用。

Manumycin对白血病细胞生长及survivin基因表达的影响

目的:观察不同浓度的Manumycin对白血病K562细胞生长及survivin基因表达的影响,初步探讨其诱导细胞凋亡的分子机制。方法:体外培养K562细胞,采用不同浓度的Manumycin(0、0.5、1、2、4、8μmol/L)掺入细胞,作用48h后采用MTT法检测细胞增殖抑制率,流式细胞术检测凋亡率,RT-PCR检测细胞中survivinmRNA表达。结果:MTT法显示,1～8μmol/L组对K562细胞具有明显的增殖抑制作用。流式细胞术结果显示,1～8μmol/L组均可诱导细胞凋亡(P<0.01)。RT-PCR结果显示1～8μmol/L组细胞的survivinmRNA水平明显低于空白对照组(P<0.01)。结论:Manumycin可有效抑制K562细胞的增殖,诱导其凋亡,分子机制可能与下调survivin的表达有关。

法尼基转移酶抑制剂Manumycin诱导HepG2细胞凋亡的研究

目的:研究法尼基转移酶抑制剂Manumycin对人肝癌HepG2细胞的抗肿瘤作用,并探讨其诱导凋亡的分子机制。方法:采用MTT(Methythiazolyltetrazolium)法观察法尼基转移酶抑制剂Manumycin对肝癌细胞株HepG2细胞增殖的抑制作用,荧光显微镜、DNA凝胶电泳、流式细胞术等技术检测细胞凋亡,应用Westernblot方法检测bcl-2、p53、bax的蛋白水平变化。结果:法尼基转移酶抑制剂Manumycin能明显抑制HepG2细胞的生长且呈浓度依赖性,其IC50为(17.65±0.58)μmol/L。荧光显微镜检查显示Manumycin处理的HepG2细胞DAPI染色后,细胞核内可见浓染致密的颗粒荧光,典型细胞可见新月型改变,固缩或片段化的核。DNA凝胶电泳可见典型的DNA梯形带。流式细胞DNA直方图上出现典型的亚二倍体“凋亡峰”,细胞凋亡与Manumycin作用的时间和浓度相关。Manumycin能时间依赖性地诱导HepG2细胞发生G2/M期阻滞。Manumycin处理HepG2细胞后,Westernblot检测结果显示p53蛋白表达明显增加,而bcl-2蛋白和bax蛋白表达无明显变化。结论:法尼基转移酶抑制剂Manumycin对人肝癌细胞株HepG2有强烈的细胞毒作用,其分子机制可能是诱导HepG2细胞凋亡。Manumycin诱导HepG2细胞凋亡与bcl-2蛋白和bax蛋白表达水平无关。

Manumycin的2D NMR研究

应用 1DNMR和梯度 2DNMR技术 ( gCOSY ,gNOESY ,gHSQC ,gHMBC)深入研究了从链霉菌发酵物中分离提取得到的Manumycin的结构 ,并对其1 H和1 3CNMR化学位移进行了全归属 .

Manumycin对人肝癌HepG2细胞的生长抑制作用与Ras通路的关系

背景与目的:目前肝癌药物治疗的临床疗效还不尽人意。在肝癌的发生发展过程中,Ras起着重要的作用。Ras必须在法尼基转移酶的作用下,经过法尼基化修饰才具有生物活性。我们观察了法尼基转移酶抑制剂Manumycin对人肝癌HepG2细胞株生长的抑制作用,并探讨其对Ras通路的影响。方法:应用氚标胸腺嘧啶脱氧核苷掺入实验观察法尼基转移酶抑制剂Manumycin对人肝癌HepG2细胞株生长的抑制作用,Westernblot技术检测Manumycin对HepG2细胞Ras通路相关蛋白,包括pan-Ras、N-Ras、membrane-pan-Ras、ERK1/2、p-ERK1/2、AKT、p-AKT及MKP-1表达的影响。结果:Manumycin(5、10、20、40、80μmol/L)处理24h对肝癌HepG2细胞株生长具有明显的抑制作用,并呈浓度依赖性,其IC50为(17.1±2.6)μmol/L。同时Westernblot分析显示,Manumycin对肝癌HepG2细胞pan-Ras蛋白和N-Ras蛋白及细胞膜pan-Ras蛋白表达均有抑制作用,且对细胞膜pan-Ras蛋白的抑制作用更明显。进一步研究发现Manumycin对Ras蛋白下游ERK1/2和AKT活性也有抑制作用,表现为ERK1/2和AKT磷酸化水平降低。Manumycin对AKT活性的影响与PI3K抑制剂Wortmannin作用相似,两者联用可加强对AKT的抑制。此外,Manumycin诱导MKP-1的表达具有浓度依赖性。

Manumycin诱导细胞凋亡抑制乳腺癌细胞SK-BR-3活性

目的研究manumycin对乳腺癌腹腔转移癌细胞株SK-BR-3的抑癌效应及其诱导凋亡。方法用MTT法检测manumycin对SK-BR-3细胞的抑癌作用。免疫印迹方法检测p38MAPK蛋白表达。用caspase-3活性检测试剂盒定量检测manumycin诱导细胞凋亡的水平及评估特异性的p38MAPK抑制剂SB203580对凋亡的影响。结果经6μmol/L、18μmol/L、54μmol/Lmanumycin处理SK-BR-3细胞24h时,其抑制率分别为(74±39)%、(210±44)%和(647±41)%,呈量效关系。其中后2者的细胞活性与对照组比有显著差异(P<001)。用药24h的IC50为425μmol/L。同时此药物可明显增加caspase-3的活性,且这一效应可部分地被p38抑制剂SB203580阻断。免疫印迹结果显示manumycin促进p38的磷酸化。结论manumycin可通过诱导SK-BR-3细胞凋亡而产生抑癌作用,p38MAPK是manumycin诱导细胞凋亡的通路之一。

氧化还原状态的改变控制手霉素诱导HL-60白血病细胞凋亡

目的研究手霉素对HL-60白血病细胞的作用,探讨其作用机制,主要是线粒体的改变。方法使用人的白血病细胞株HL-60细胞。MTT细胞毒性测定评价对白血病细胞的作用,使用Annexin V和一氧化氮(nitric oxide,NO)染料标记细胞,应用流式细胞仪术检测细胞内NO生成和细胞凋亡。细胞内超氧阴离子通过二氢乙啶(dihydroethidium,DHE)测定。应用化学发光法测定超氧歧化酶(superoxide dismutase,SOD)活性。采用荧光法测定谷胱甘肽(glutathi-one,GSH),萤光素-萤光素酶发光法测定ATP含量。免疫印迹技术检测细胞色素C和Mn-SOD的表达。结果手霉素引起HL-60细胞活性的下降,且呈剂量依赖性。手霉素诱导产生反应性氧基(reactive oxygen species,ROS):NO和超氧阴离子,降低GSH,但不影响SOD。手霉素诱导线粒体降低细胞ATP的含量,线粒体肿胀和细胞色素C从线粒体释放到细胞质。手霉素诱导的凋亡与ROS的增加有关。用N-乙酰基-L-半胱氨酸(N-acetyl-L-cysteine,NAC)抑制ROS可保护HL-60细胞逃避手霉素的细胞毒作用和避免手霉素诱导的凋亡。结论细胞内ROS的产生对手霉素的细胞毒作用起非常重要的作用。手霉素通过包括上游ROS产生,线粒体形态改变和细胞色素C释放的线粒体途径,诱导白血病细胞凋亡。

甲氧胺联合手霉素对白血病U937细胞凋亡的影响

背景与目的:DNA损伤修复对细胞生存很重要。我们既往的研究发现手霉素可诱导肿瘤细胞出现DNA损害反应。因此,碱基切除修复抑制剂甲氧胺(methoxyamine)有可能增强手霉素(manumycin)的抗肿瘤作用。为此,本实验研究甲氧胺对手霉素诱导白血病细胞凋亡的影响,探讨联合甲氧胺和手霉素诱导白血病细胞凋亡过程中线粒体凋亡途径的变化。方法:不同浓度手霉素和甲氧胺处理U937细胞48h后,MTT细胞毒性测定U937细胞存活率,软琼脂法检测细胞的克隆形成。应用流式细胞术检测细胞凋亡。免疫印迹技术检测细胞色素C、Caspase-9、聚腺苷核糖聚合酶(poly-adenosyl ribose polymerase,PARP)的表达。中位效应方法评价两药的相互作用。结果:甲氧胺使手霉素的剂量反应曲线向左边移动,结合指数(CI)<1(P<0.05)。1μmol/L手霉素、5mmol/L甲氧胺和联合两药处理U937细胞,相对于对照组的克隆形成分别是0.3641±0.0463,0.7541±0.0379,0.0473±0.0024(联合用药组与对照组、手霉素组或甲氧胺组相比,P<0.05);进一步发现,联合两药协同诱导细胞凋亡,引起Annexin V荧光值增加,阳性细胞增加,分别是(2.34±0.30)%、(8.80±0.95)%、(2.21±0.19)%、(13.37±0.91)%,联合用药组与对照组、手霉素组或甲氧胺组相比,差异有统计学意义(P<0.05)。联合甲氧胺和手霉素增强细胞色素C从线粒体释放到细胞浆,Caspase-9激活,PARP特异性裂解。结论:甲氧胺增强手霉素通过线粒体凋亡途径诱导U937细胞凋亡,提示甲氧胺联合FTIs和DNA修复抑制剂治疗白血病的可能性。

手霉素通过上调P53诱导22Rv1前列腺癌细胞凋亡

目的探讨手霉素对前列腺癌(prostate cancer,PC)细胞株22Rv1细胞的作用及其机制。方法使用MTT细胞毒性测定法评价人22Rv1细胞的活性,使用Annexin v和碘化丙啶(Propidium Iodide,PI)染料标记细胞,应用流式细胞术检测细胞凋亡。采用免疫印迹技术检测Caspase-3、H2AX和P53蛋白的表达。结果手霉素有效杀伤前列腺癌22Rv1细胞,随着手霉素剂量的增加,细胞活性逐渐下降。手霉素能诱导22Rv1细胞凋亡,早期凋亡率和晚期凋亡率均增加。手霉素通过caspase途径有效诱导22Rv1细胞凋亡。同时手霉素快速增加22Rv1细胞H2AX磷酸化和上调P53的表达。结论手霉素通过上调P53的表达和激活H2AX诱导前列腺癌细胞凋亡,杀伤前列腺癌细胞。

手性霉素联合磷脂酰肌醇-3激酶抑制剂对人卵巢癌细胞的抑制作用

目的:研究手性霉素(Manumycin)联合磷脂酰肌醇-3激酶抑制剂(LY294002)对人卵巢癌细胞株的抑制作用,为临床治疗中晚期妇科肿瘤提供实验资料。方法:Manumycin和LY294002分别及联合在不同药物浓度下作用于人卵巢癌细胞株HO8910PM和OVCAR-3,用MTT法评价其抑癌效果。结果:Manumycin单独使用,对HO8910PM和OVCAR-3的IC50分别为70.3μM/L和59.8μM/L;LY294002单独使用,对HO8910PM和OVCAR-3的IC50分别为76.7μM/L和26.5μM/L;Manumycin与LY294002联用(固定LY294002浓度),对HO8910PM和OVCAR-3的IC50分别为68.5μM/L和32.9μM/L,LY294002与Manumycin联用(固定Manumycin浓度),对HO8910PM和OVCAR-3的IC50分别为65.0μM/L和13.6μM/L。结论:Manumycin和LY294002对人卵巢癌细胞株均有抑制作用,与单独用药相比,二者联用有显著增效作用。

手霉素对白血病干细胞和骨髓干细胞的细胞毒作用

目的探讨手霉素对白血病干细胞(LSC)的细胞毒作用。方法采用MTT法检测手霉素对LSC的细胞增殖抑制作用,采用Annex-inⅤ-FITC法检测LSC细胞凋亡情况并采用流式细胞术分析细胞周期。结果随着手霉素浓度的增高,LSC细胞增生抑制率明显增高,细胞凋亡率也逐渐增高,且阻滞于G2/M期的细胞比率明显增加。结论手霉素通过阻滞LSC于G2/M期,促进凋亡而抑制其增长,而对正常造血干细胞(HSC)无细胞毒作用。

手霉素对食管癌Eca109细胞增殖和凋亡的影响

目的:探讨手霉素对食管癌细胞Eca109体外增殖活性的影响及其作用机制。方法:用不同浓度的手霉素(10、20、40、80、120μmol/L)处理Eca109细胞24、48和72 h后,采用MTT方法测定肿瘤细胞生长抑制率;吉姆萨染色和透射电镜技术观察手霉素对食管癌细胞Eca109形态变化的影响;流式细胞分析技术检测手霉素对Eca109细胞周期和凋亡的影响。结果:不同浓度的手霉素对Eca109细胞增殖均有明显的抑制作用,与对照组相比,差异均有统计学意义(P<0.05);Giemsa染色及透射电镜结果显示手霉素诱导Eca109细胞出现较典型的细胞凋亡形态学变化及超微结构改变;流式细胞分析结果显示,10、20、40、80和120μmol/L的手霉素作用Eca109细胞48 h后的细胞凋亡率分别为4.520%±1.035%、14.490%±1.707%、28.883%±4.299%、35.107%±2.276%、47.940%±8.126%,与对照组凋亡率(1.370%±0.028%)相比,差异均具有统计学意义(P<0.05);且凋亡率呈明显的剂量依赖关系;而细胞周期分布显示G2/M期细胞显著增多。结论:手霉素体外可显著抑制人食管癌细胞Eca109增殖,诱导细胞凋亡可能是其重要途径。

手霉素对甲状腺癌KAT-18细胞的作用及其机制

目的:探讨手霉素对甲状腺未分化癌KAT-18细胞株的作用及其机制。方法:使用SRB细胞毒性测定法评价KAT-18细胞的活性,使用Annexin v和一氧化氮(NO)染料标记细胞,应用流式细胞术检测细胞内NO生成和细胞凋亡,二氢乙啶(DHE)方法测定细胞内超氧阴离子。应用化学发光法测定超氧歧化酶(SOD)活性,Mn-SOD的表达采用免疫印迹技术检测。谷胱甘肽(GSH)含量采用荧光法测定。结果:手霉素有效杀伤KAT-18细胞,随着手霉素剂量的增加,细胞活性逐渐下降。手霉素诱导产生NO和超氧阴离子,降低GSH,但不影响Mn-SOD的蛋白表达和6 h的SOD活性,但24 h的SOD活性代偿性增加。手霉素诱导的凋亡与NO和超氧阴离子增加及GSH下降有关。用N-乙酰基-L-半胱氨酸(N-acetyl-L-cysteine,NAC)抑制NO和超氧阴离子产生,提高GSH可减少手霉素诱导KAT-18细胞凋亡,从而逃避细胞被手霉素杀伤。结论:手霉素通过细胞内NO和超氧阴离子的产生诱导甲状腺癌细胞凋亡,杀伤甲状腺癌细胞。

手霉素抗肿瘤及诱导细胞凋亡作用的实验研究

目的研究手霉素(manumycin)的体外抗肿瘤及其诱导肿瘤细胞凋亡的作用,初步探讨手霉素抗肿瘤作用机制,为将来这种新型药物的抗肿瘤作用开发提供理论基础和临床应用提供试验依据。方法MTT法检测药效动力学特征;采用Gimsa染色技术、透射电镜技术、流式细胞技术、DNA提取及琼脂糖凝胶电泳技术测定和观察癌细胞凋亡的情况;流式细胞技术检测凋亡相关基因bcl-2、bax表达水平。结果手霉素抑制细胞生长呈时效和量效关系;Gimsa染色、透射电镜结果显示手霉素诱导人乳腺癌细胞株MCF-7出现较典型的细胞凋亡形态学变化及超微结构改变;流式细胞分析的DNA直方图上可见G1期峰出现细胞凋亡峰亚G1期峰,乳腺癌细胞的周期也发生了改变,多数细胞被阻滞在G2/M期;琼脂糖凝胶电泳可观察到具有凋亡特征的梯形条带;流式细胞仪分析的实验结果显示手霉素作用MCF-7细胞前后bcl-2和bax蛋白表达水平无明显改变。结论(1)手霉素体外具有很强的抗肿瘤作用,可以抑制多种细胞增殖。(2)诱导肿瘤细胞凋亡是手霉素发挥抗肿瘤作用的一条重要途径。经手霉素作用后,肿瘤细胞bcl-2和bax蛋白表达水平无明显变化,手霉素诱导肿瘤细胞凋亡作用并非通过调控bcl-2和bax的表达水平实现。

手霉素通过阻断PI3K／Akt信号通路诱导U937白血病细胞凋亡

目的:探讨手霉素对U937白血病细胞的作用及其机制。方法:2μmol/L的手霉素处理U937白血病细胞不同时间,分别使用Annexin V/PI试剂及ROS检测试剂标记细胞后,应用流式细胞术检测细胞凋亡及细胞内ROS生成,免疫印迹术检测PI3K、P-Akt、Akt等蛋白的表达。结果:与0 h对照组相比,随着处理时间的延长,手霉素诱导的U937细胞凋亡(P<0.05)及ROS生成逐渐增加(P<0.05),对PI3K/Akt信号通路活化的抑制逐渐增强。N-乙酰基-L-半胱氨酸(NAC)(能有效抑制ROS产生的物质)可以阻断手霉素对U937细胞内PI3K/Akt信号通路的抑制及手霉素诱导的U937细胞凋亡。结论:手霉素通过诱导ROS产生进而抑制PI3K/Akt信号通路活化来诱导U937细胞凋亡。

新抗生素H4750-D_2的研究——发酵、分离、结构鉴定和生物活性

化合物Ｈ４７５０－Ｄ２是从稀有放线菌小多孢菌（Ｍｉｃｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａｓｐ）Ｈ４７５０菌株的培养液中经溶媒萃取、硅胶柱层析、ＳｅｐｈａｄｅｘＬＨ－２０凝胶过滤和反相硅胶柱层析分离得到。经理化性质鉴定和光谱分析（ＵＶ、ＩＲ、１Ｈ－ＮＭＲ、１３Ｃ－ＮＭＲ、ＤＥＰＴ、１Ｈ－１ＨＣＯＳＹ、１３Ｃ－１ＨＣＯＳＹ、ＨＲＦＡＢ－ＭＳ），得知该化合物为一新的手霉素族抗生素。