湘产高温大曲主发酵期微生物群落演替及主要酶系动态分析

高温大曲是酱香型白酒的发酵剂、糖化剂和生香剂,具有丰富的微生物及酶系,在白酒酿造过程中发挥着举足轻重的作用。对高温大曲主发酵期微生物的群落结构及酶系的动态变化规律进行分析,以阐明微生物和酶系的作用机理。该研究采用高通量测序技术结合酶活力测定方法,分析高温大曲不同发酵时期的微生物群落结构及酶系变化。结果表明,高温大曲主发酵期间酶活力的变化明显,以制曲工艺的第1次翻曲(第9天),第2次翻曲(第15天)这2 d的木聚糖酶、纤维素酶、单宁酶的酶活力出现拐点。利用高通量测序技术解析高温大曲发酵过程中微生物群落结构的变化,结果表明细菌10个属和真菌5个属区分组间差异的关键成分:细菌属为枝芽胞杆菌属(Virgibacillus)、Kroppenstedtia、魏斯氏菌属(Weissella)、Sediminibacterium、鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas)、芽孢杆菌属(Bacillus)、乳杆菌属(Lactobacillus)、肠杆菌属(Enterobacter)、火山渣芽胞杆菌属(Scopulibacillus)和志贺氏菌属(Escherichia.Shigella);真菌属为假丝酵母菌属(Candida)、红曲霉属(Monascus)、Leiothecium、Millerozyma和酿酒酵母属(Saccharomyces)。并由他们来驱动整个高温大曲发酵期间微生物群落结构的演变。该研究通过现代生物技术对湘产高温大曲微生物和酶系变化规律进行研究,为制曲工艺的优化、强化曲的制备以及酱香型白酒酒质的改良提供一定的理论依据。

高温大曲制曲过程中水解酶系及理化性质的动态变化研究

为研究高温大曲在制曲过程中酶活力及理化指标的变化规律,对高温大曲制曲周期内8种主要水解酶系酶活力及其理化性质进行了测定。结果表明,随着制曲时间的延长,高温大曲液化酶、糖化酶、纤维素酶、半纤维素酶、酸性蛋白酶、中性蛋白酶的酶活力以及发酵力、酯化力整体呈现先上升后下降再上升的趋势;理化指标中还原糖和酸度在制曲前期均有一定程度的提升,在制曲后期逐渐下降,而水分和淀粉的含量整体呈现下降的趋势。该研究结果可为高温大曲制曲过程工艺控制和质量标准体系的建立提供技术支撑。

酱香型白酒高温大曲储存过程中微生物群落演替与理化因子相关性研究

目的:本研究分析了酱香型白酒高温大曲在储存过程中(0~150 d)的理化特性和微生物的变化过程,以期了解大曲的老化成熟规律。方法:该研究基于传统可培养方法和高通量测序技术分析大曲在储存过程中微生物群落结构演替规律,结合相关性分析理化因子和微生物之间的关系。结果:储存过程中的可培养微生物的数量呈现先增加后下降的趋势;温度和糖化力指标呈先上升后下降的趋势,水分、酸度随着存储时间的增加呈现下降的趋势。储存过程中的主要优势细菌属为Kroppenstedtia、Lactobacillus、Staphylococcus、Enterobacter;主要优势真菌属为Thermomyces、Trichomonascus、Byssochlamys。微生物群落与理化指标间存在复杂的作用关系,Bacillus、Kroppenstedtia、Aspergillus、Trichomonascus与温度呈正相关关系;Byssochlamys、Dipodascus与温度、水分、酸度、液化力呈正相关关系;Thermomyces与温度、水分、酸度呈负相关关系。结论:本研究揭示了酱香型高温大曲在储存过程中微生物群落组成情况及理化因子间的相互关系,为进一步阐明酱香型白酒高温大曲后熟机理提供了理论参考。

大曲酱香酒味觉体验中的苦味

标准大曲酱香酒中苦味体验是客观存在的。苦味的来源一方面是“曲大酒苦”,另一方面来源于原辅料、生产酿造、蒸馏、贮存过程之中。大曲酱香酒老酒、陈酒中更容易出现苦味。这样的酒作为调味酒可以提高酒体醇厚感和酒体丰富度、丰满度。中国白酒其它香型大部分排斥苦味,而大曲酱香酒中的苦味确是不可或缺的重要味觉体验。苦味存在的意义延展了人们的味域,拉长了感官风味中口味体验的长度,与其它呈香、呈味物质一起形成了独特的大曲酱香酒口味偏好性。属于中、重酒体的大曲酱香酒在十二大香型白酒中之所以属于终极版消费,苦味体验是构成因素之一。大曲酱香酒感官风味中苦味体验必须恰到好处“,含而不露”或微有苦味(苦味长度不超过6s)。苦味必须与其它呈香、呈味物质协调共生,“糊苦”、“焦苦”、“枯苦”不受欢迎,苦味轻柔被其它香味裹挟、包裹,起到了香味对比,形成了香味落差,才会受到欢迎。

酱香型白酒大曲和糟醅的细菌多样性分析

采用Illumina HiSeq 2500测序系统全面剖析酱香型白酒中的高温制曲和发酵酿酒阶段的细菌群落结构。结果显示:酱香型白酒高温制曲阶段和发酵酿酒阶段大曲和糟醅的细菌菌群在数量及结构分布上均具有多样性特点,菌群种类基本一致。两个阶段的优势菌门均为厚壁菌门Firmicutes、变形菌门Proteobacteria、放线菌门Actinobacteria、拟杆菌门Bacteroidetes 4类。高温制曲和发酵酿酒生态环境之间存在差异,导致微生物优势菌不同。另外,随着发酵时间的推移,酱香型白酒酿造过程中微生物群落呈现一定的变化规律,大曲样本的细菌菌类变化与贮存时间有关,优势菌属有Clostridium sensu stricto 1、Escherichia-Shigella、Lactobacillus、Streptococcus、Actinobacillus、Bifidobacterium、Peptoclostridium、Mycoplasma、Citrobacter等,诸如Escherichia-Shigella、Actinobacillus、Bifidobacterium、Citrobacter等细菌随贮存时间的延长而增加,Clostridium sensu stricto 1、Mycoplasma等表现为先上升后下降,而Lactobacillus、Peptoclostridium等无明显变化,Streptococcus等细菌呈现下降趋势。而糟醅微生物随窖池发酵(起窖)及高温堆积(下窖)的工艺而不断变化,发酵酿酒阶段的优势微生物为Escherichia-Shigella、Lactobacillus、Clostridium sensu stricto 1、Streptococcus、Actinobacillus、Bifidobacterium、Alternaria。相对丰度较高的细菌菌属中Escherichia-Shigella、Lactobacillus在发酵前期菌数先升高,中期从第2轮次开始下降,第3轮次下窖时达到最低,后期逐渐上升。Clostridium sensu stricto 1、Streptococcus菌群丰度变化规律复杂,呈现先下降后上升的趋势。结果表明:高温制曲与发酵酿酒阶段的优势菌菌属基本一致,说明大曲是后续糟醅发酵的微生物来源。另外,细菌的生长耐受性范围较广,随着时间的推移,温度和水分达到相对平衡,细菌群落也逐渐得到了调整,形成单一菌类为主导的环境,更有利于酱香酒的酿造。

酱香型大曲中分离到的阿姆斯特丹散囊菌产酶产香特性

为了探究酱香型大曲中霉菌的种类及其功能,采用稀释平板涂布法从遵义地区的6个企业的酱香型大曲中分离筛选霉菌菌株,结合形态观察和真菌r DNA-ITS基因序列同源性比对进行分析。在其中5个企业的大曲样品中均能筛选分离得到一株散囊菌,归类并命名为阿姆斯特丹散囊菌(Eurotium cristatus)。以茅台大曲筛选的阿姆斯特丹散囊菌(FBKL3.0120)为研究对象,该菌株产糖化型淀粉酶活力最高,达到(3 100.16±109.43)U/g,酸性蛋白酶活力为(225.69±2.69)U/g、果胶酶活力为(435.88±68.49)U/g、脂肪酶与纤维素酶活力分别为(13.56±1.73)U/g和(4.14±0.16)U/g。采用固相微萃取-气质联用技术对固态发酵的挥发性香味物质进行结果分析,该菌固态发酵具有很强花香和果蔬香,挥发性香味物质以高级醇、酮和呋喃类为主,其中L-芳樟醇、1-辛烯-3-醇、3-辛酮、2-戊基呋喃的相对含量较高,分别为挥发性物质的16.37%、41.23%、6.95%、6.75%。分离得到的这株阿姆斯特丹散囊菌(FBKL3.0120)是一株产多种酶并同时产多种香气成分的霉菌,是酱香大曲微生物组成中的重要霉菌之一。

贵州省遵义地区3个酱香型大曲细菌群落的比较分析

研究酱香型大曲主要产地遵义地区的细菌类群组成,并利用主成分分析法对这些细菌的类群和大曲的关系进行评定。样品采用454 FLX＋平台进行测序,样品中所测微生物为细菌,测序片段为16S r DNA V3~V5区,所有样品的优质序列按97%的相似度进行聚类,计算这些细菌类群的相对含量。用主成分分析法对细菌类群和大曲样品进行分析,结果显示：从3个大曲样品中共检测出6个门49个属细菌,主要是厚壁菌门;样品MT01以高温放线菌属（Thermoactinomyces）34.40%、芽孢杆菌属（Bacillus）31.40%、Scopulibacillus 13.60%为主,占总量的79.40%,样品ZJ01以高温放线菌属（Thermoactinomyces）34.80%、芽孢杆菌属Bacillus 49.00%为主,占总量的84.80%,样品ZX01以高温放线菌属（Thermoactinomyces）66.10%为主;对3个大曲样本进行主成分分析,发现棒状杆菌属（Corynebacterium）、魏斯氏菌属（Weissella）是影响样品MT01与ZJ01距离最近,ZX01相对距离较远的细菌类群。

酱香型大曲中酵母的分离与鉴定

采用传统分离培养方法,对不同颜色和不同存储时间酱香大曲中的酵母菌进行分离,从中共筛选到60株酵母,并通过菌落形态观察、生理生化实验和分子生物学方法对其进行鉴定。结论:酱香大曲中酵母菌的种属有毕赤氏酵母属、伊萨酵母属、假丝酵母属、丝孢酵母属、酵母属、德巴利酵母属和复膜孢酵母属,其中,伊萨酵母属、德巴利酵母属和复膜孢酵母属是首次以传统方法从酱香大曲中分离筛选出,这也表明酱香大曲中酵母具有高度多样性。

茅台酒大曲中3株耐高温霉菌的分离纯化及鉴定

用高温富集法从太空搭载的茅台酒大曲中筛选到3株在50℃以上可旺盛生长的霉菌,通过归属鉴定,它们分别为Gilmaniella、Gilmaniella和Absidia;最适生长温度分别为50℃、50℃和45℃,最适pH分别为4.0、4.0和4.5,热致死温度分别为70℃、70℃和65℃。

茅台镇大曲虫害调研与防治分析

通过调研茅台镇部分生产企业大曲的虫害现象和人们对曲虫的认识,了解到茅台镇大曲曲虫以蟑螂、咖啡豆象、土耳其扁谷盗为主要种群。关于曲虫的危害,大多数被调查者认为曲虫对生产无影响。归纳已有的曲虫防治措施,针对茅台镇酱香型大曲的生产、使用特点及白酒生产的卫生情况,建议不使用化学方法防治曲虫,提出曲虫的防治应在大曲生产、贮存及用曲等方面入手,结合生物和物理等方法进行综合防治。

应用PCR-DGGE技术分析酱香型白酒酒曲细菌多样性

利用PCR-DGGE技术研究酱香型白酒制曲过程中的细菌菌群结构及其消长规律,鉴定出不同样品的优势菌群。结果表明,酱香型大曲间的细菌组成存在明显差异,母曲与出仓曲的相似性系数仅为0.29。随着曲药的发酵,细菌多样性下降,优势菌群变化明显。其中,芽孢杆菌属(Bacillus)、明串珠菌属(Leuconostoc)、片球菌属(Pedio-coccus)、魏斯氏菌属(Weissella)、棒状杆菌属(Corynebacterium)、高温放线菌属(Thermoactinomyces)和乳酸杆菌属(Lactobacillus)是母曲和翻仓曲的优势菌群,而出仓曲的主要类群为芽孢杆菌属(Bacillus)和乳酸杆菌属(Lactobacil-lus)。另外,还发现了在白酒曲药中不曾报道的种群和不能培养的细菌:Uncultured Propionibacteriaceae bacterium、Uncultured Weissella sp.、Uncultured cyanobacterium,该技术克服了传统分离培养的缺点。

大曲中产酱香芽孢杆菌的筛选及其代谢产香探析

对茅台酒生产各环节所采集的28个样品进行了初步分析,从高温大曲制作过程的不同环节筛选出芽孢杆菌104株,用麦曲模仿升温发酵筛选产香的菌株,经鉴定分别为枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌等,其中产酱香优良的菌株25株,分为多种香味,与不产香型的细菌对比,产酱香的25株均能产生二乙酰、乙偶姻、蛋白酶、淀粉酶等,结合茅台的生产流程分析了其产香的可能机制,得到结论:芽孢杆菌在大曲发酵过程中产生蛋白酶和淀粉酶等多种酶类和代谢物质,进而在高温、偏酸环境下通过美拉德反应产生吡嗪等多种茅台酒特征香味物质。

“神舟”五号飞船搭载茅台酒大曲中酵母菌的分离及特性的初步研究

对经“神舟”五号载人飞船搭载的茅台酒大曲中的酵母菌进行了分离,从中筛选出一株产酒精体积分数达6.2%和产酯达0.627 g/L的菌株MT-14作为备用菌种资源,初步鉴定为酵母属的酿酒酵母(Saccharamyces cerevisiae),其发酵特性优于厂家提供的茅台酒酵母JG3220。

酱香型大曲细菌的多样性

以酱香型大曲为研究对象,研究酱香型大曲细菌种群多样性及功能基因预测。分别采用可培养稀释平板法以及高通量测序方法分析大曲细菌群落组成,并结合功能基因筛选及高通量测序分析等宏基因组学研究手段,预测其相关基因功能。大曲细菌总数范围在106~108CFU/g,可培养法分离到的51株Bacillus sp.,1株Acinetobacter sp.。确定酱香型大曲细菌的主体类群组成为以厚壁菌门(87.3%~91.8%)为主要类群,其次是放线菌门(3.3%~9.1%),并发现了未曾报道过的蓝细菌门Cyanobacteria(0.1%~1.5%)。确定了以Thermoactinomyces sp.和Bacillus sp.为主的酱香型大曲细菌群落结构组成,其相对含量占细菌总量的60%以上。通过第二代高通量测序方法还对大曲样品中细菌的代谢功能基因进行了预测。

酱香大曲中产香细菌发酵产蛋白酶的条件优化

从茅台酱香型白酒生产用大曲中分离的一株细菌HMZ-D,对固态发酵产蛋白酶的发酵温度、pH值、水分含量、接种量、发酵时间、原料配比等影响因素进行研究。结果表明,对菌株发酵产蛋白酶影响因素大小顺序为发酵时间(D)>水分含量(C)>温度(B)>接种量(A);正交试验结果所得到的菌株产酶最优方案为10%接种量、发酵温度35℃、含水量40%、发酵时间6d,在此发酵条件下蛋白酶酶活为2901.3U/g醅。

微生物技术在酱香型白酒生产中的应用研究

将从大曲酱香白酒生产大曲中分离得的5株嗜热芽孢杆菌、3株酵母菌应用于酱香型白酒生产。结果表明:①应用5株嗜热芽孢杆菌培养制得的高温大曲曲香馥郁,幽雅纯正;②应用嗜热芽孢杆菌、酵母菌与曲药、糟醅混合高温堆积,糟醅复合酱香明显;③应用复合产酸菌、培养窖泥,用于窖底,提高了窖底香和酒产率。所生产的酱香型白酒品质优良,酱香风格典型。

酱香型高温大曲中功能菌B_(3-1)菌株的分离、选育及其分类学鉴定

以酱香型白酒生产所使用的高温大曲为含菌样品,经分离获多株耐高温细菌,对它们进行生化及香气特征测定,确认B3-1菌株为主要功能菌。经形态特征、生理生化特征的测定,B3-1菌株归属于地衣芽孢杆菌。

应用麸曲和大曲相结合生产酱香型白酒

在传统的大曲酒生产工业中，应用大曲和河内白曲、生香酵母、南阳温室酵母代替部分大曲，进行酱香型白酒的生产试验，提高了原料出酒率，且酒质较稳定，经济效益显著，并对大曲、麸曲生产的新酒及贮存一年以上的陈酒进行了品评及理化分析，取得了令人满意的效果。

“浓酱结合型”白酒生产中几个值得注意的问题

“浓酱结合型”白酒生产,应高温培制大曲,高温堆积,并辅以高温芽孢杆菌、意大利酵母强化发酵等技术,灵活应用,方可获得理想的独具风格的基础酒。

贮存温度对酱香型大曲品质的影响

酱香型白酒生产用大曲在10、20、30℃的温度下贮存,研究贮存期间大曲的曲虫取食量、水分含量、酸度、淀粉含量、发酵力、液化力、糖化力、酯化力、酒化力与微生物菌落总数、酵母菌、霉菌总数等的变化,结合大曲颜色、气味及气相色谱-质谱(GC/MS)分析,探讨贮存温度对酱香型大曲品质的影响。结果表明:将贮存温度控制在20℃左右,能有效降低酱香型大曲的贮存损耗,大曲的淀粉含量损失小,符合《DB 52/T 871-2014酱香型白酒酿酒用大曲》要求的程度高,生化性质稳定,有利于酱香物质的形成,减少曲虫活动带来的不良气味,并保持酱香型大曲的特征。