Bohaisea-9145海洋低温碱性脂肪酶研究

从 2 0 0 0多份渤海海区海水海泥样品中分离获得一株新型脂肪酶高产菌株BohaiSea 914 5 ,经鉴定为适冷性海洋酵母 (Yarrowialipolytica)。菌株在以豆饼粉、棉籽饼粉和花生粕作为碳氮源并添加 0 5 %花生油的培养基中能较好地生长产酶 ,最适产酶温度 2 6± 1℃ ,产酶周期为 2 3h。所得脂肪酶的最适反应温度为 35℃ ,最适pH 8 5 ,pH4 0～ 9 0范围内稳定 ,热稳定性差。该酶与常见金属离子和化学试剂的配伍性较好 ,受表面活性剂SDS的激活 ,且具有良好的耐盐及抗氧化特性 ,是一种新型的海洋低温碱性脂肪酶 。

海洋酵母菌胞外酶及其基因的最新研究进展

综述海洋酵母菌所产多种胞外酶的生产、纯酶性质及基因克隆工作的最新研究进展。从实验室建立的500多株海洋酵母菌种资源库中筛选出了数十株可以产生多种不同活性胞外酶的海洋酵母菌,它们分别属于耶鲁维亚酵母菌(Yarrowia)、类酵母(Aureobasidium)、毕赤氏酵母菌(Pichia)、梅奇酵母菌(Metschnikowia)和隐球酵母菌(Cryptococcus)等不同种属。所产生的胞外酶主要包括纤维素酶、碱性蛋白酶、酸性蛋白酶、淀粉酶(包括生淀粉酶)、菊糖酶、脂酶、植酸酶和嗜杀因子等。深入进行了各种胞外酶的生产,纯化及纯酶的性质研究,并对部分菌株的胞外酶基因进行了克隆、测序和表达,这些研究有助于对海洋酵母胞外酶的理论研究和生产应用价值的了解和对于海洋酵母菌资源、生理和遗传的进一步深入研究。

海洋微生物低温碱性脂肪酶的纯化与性质研究

以海洋微生物通过发酵制备的脂肪酶为材料 ,对该酶的分离纯化条件及理化性质进行了研究。在脂肪酶纯化中 ,采用氯仿萃取、中空纤维柱超滤及CM SepharoseFF阳离子交换柱层析等技术对发酵制备的脂肪酶进行了纯化 ,结果得到达到电泳纯的脂肪酶。在脂肪酶理化性质研究中 ,采用SDS PAGE电泳对该脂肪酶分子量进行测定 ,并在实验中以橄榄油为底物采用脂肪酶酸碱滴定测活法 ,对脂肪酶的最适水解条件、各种因素对脂肪酶稳定性的影响进行了研究。结果显示 ,该脂肪酶分子量为 ( 38 0± 1 )kD ,最适水解温度为 35℃ ,最适pH为 8 5 ,为一低温碱性脂肪酶。该脂肪酶可在 35℃以下、pH =4 0— 9 0范围内保持良好的稳定性 ,与常见金属离子、化学试剂等的配伍性较好 ,并且具有良好的耐盐及抗氧化性能。研究中还以p NPL(月桂酸对硝基苯酚酯 )为底物采用脂肪酶化学发光测活法 ,对脂肪酶进行了酶促动力学的研究。结果表明 ,该脂肪酶在最适条件下Km 值为 7 80 5 μmol/L ,Vmax为 1 2 385mmol/ (L·min)。通过对Zn2 +抑制脂肪酶水解活性的研究 ,发现Zn2 +对脂肪酶具有可逆抑制作用 ,从而筛选到该脂肪酶的可逆抑制剂Zn2 +。

黄海黄杆菌YS-9412-130低温碱性蛋白酶的制备工艺研究

对黄海黄杆菌所产低温碱性蛋白酶的工业生产技术和电泳纯级试剂酶的分离纯化工艺进行了实验。按照设计的中试生产技术 ,每吨发酵液可得酶粉 2 0 kg,粗酶比活大于 2 0× 10 4 U/ g;同时运用一系列纯化手段和条件 ,制备出电泳纯级试剂酶 ,纯化过程蛋白回收率在 7%左右 ,活性回收率在60 %以上 ,比活性也稳定在 1.9× 10 3U/ mg以上 ,激光灰度扫描结果试剂酶纯度大于 99% ,可以作为试剂酶满足进一步生物学研究和实际应用。其产品质量和制造工艺均达到了中试放大规模的要求。

黄海黄杆菌YS-9412-130低温碱性蛋白酶性质鉴定

对黄海黄杆菌 YS- 94 12 - 130菌株产低温碱性蛋白酶的理化性质研究表明 ,该酶由 2 56个氨基酸组成 ,分子量为 330 0 0 Dar,等电点 p I为 9.4 5,米氏常数 Km为 5× 10 -3 m mol/ L;酶的最适作用p H范围为 9.5～ 10 .5,最适作用温度 30℃ ,具有一定的抗氧化稳定性。Ca2 +、Mn2 对酶有激活作用 ,而 Hg2 +、Ag+对酶有抑制作用。 DFP、NBS严重抑制酶的活性 ,而同时该酶也能被 EDTA抑制。结果表明该低温碱性蛋白酶为一新型的丝氨酸蛋白酶。

黄海黄杆菌YS-9412-130低温碱性蛋白酶活性必需基团分析

用化学修饰法结合酶的紫外吸收光谱变化研究黄海黄杆菌 YS- 94 12 - 130分泌的海洋低温蛋白酶的功能基团性质 ,结果表明 ,羟基、咪唑基、ε-氨基及胍基均与酶活性有关 ,而羧基、巯基与酶活性无关。酶的性质与丝氨酸蛋白酶有很大的相似性。

产脂肪酶海洋嗜冷菌的鉴定及酶学性质研究

从东海的深海底泥中筛选出一株产脂肪酶的海洋细菌 EastSeaG5-1415,该菌为革兰氏阴性好氧菌,短杆状,0.9～1.3μm×1.5～3.8μm,无鞭毛,无芽孢,无色素,菌落光滑不透明,过氧化氢酶和氧化酶阳性,甲基红实验阴性,氧化葡萄糖产酸,可耐受10%的 NaCl。此菌最适生长温度为18%,最高生长温度为35℃,在0℃也能生长,是典型的嗜冷菌。菌株脂肪酸种类为 C_(17∶1)(28.2%),C_(18∶1)9_c(49.7%),辅酶 Q-8是其主要的异戊烯醌类,DNA中 G+C 含量为45.2mol%。以16SrRNA 同源性为基础构建了相关种属细菌在内的系统发育树,在系统发育树中,分离菌株 EastSeaG5—1415与 Psychrobacter glacincola 在同一分支,二者的序列相似性为97.6%,DNA 杂交显示与 P.glacincola 最为相近,达到87%。结合形态和生理生化试验,将其鉴定为嗜冷杆菌 P.glacincola。同时对其所产脂肪酶的性质进行了初步研究。该菌所产碱性脂肪酶最适反应温度为35℃,在5℃时仍有较高酶活,酶活达到23%,最适 pH 值为9,属低温碱性脂肪酶。

海洋低温碱性蛋白酶的急性毒性研究

应用酶工程技术 ,得到在室温下有较高酶活力的海洋低温碱性蛋白酶。为对海洋低温碱性蛋白酶进行安全性评价 ,作者应用小鼠和大鼠急性毒性试验及最大耐受量 ( MTD)测定 ,观察海洋低温碱性蛋白酶对小鼠 1次口服后产生的急性毒性反应和大鼠完整皮肤短期内接触海洋低温碱性蛋白酶所产生的毒性反应。结果表明 ,小鼠 1次口服海洋低温碱性蛋白酶的 MTD>2 0 g/kg为实际无毒物 ,其中毒的靶器官是肝脏 ,未见大鼠经皮的急性毒性反应。

海洋低温碱性蛋白酶的刺激性研究

探究海洋低温碱性蛋白酶的刺激性 ,并为其应用提供实验依据。作者应用新西兰大耳白兔 ,以 4 0 %、2 0 %和 5‰浓度的海洋低温碱性蛋白酶进行皮肤急性刺激试验 ,5‰海洋低温碱性蛋白酶的皮肤多次刺激性试验 ,1‰的海洋低温碱性蛋白酶的兔角膜刺激性试验 ,评价其安全性。结果表明 ,5‰和 2 0 %海洋碱性蛋白酶单次应用实验皮肤未出现红斑和水肿 ,对皮肤无刺激性。 4 0 %海洋低温碱性蛋白酶液对皮肤有中度刺激性。皮肤病理学显示 5‰的海洋低温碱性蛋白酶液未见皮肤的慢性刺激反应 ,皮肤结构完整、层次清晰。

壳聚糖固定化海洋低温碱性蛋白酶YS-80-122的研究

以壳聚糖为固定化载体,采用吸附交联法,以戊二醛为交联剂,对海洋低温碱性蛋白酶YS-80-122进行固定化。通过单因素和正交试验优化得到最佳固定化条件为pH7·0,戊二醛终浓度0·2%,吸附时间50min,酶载体比例40mg/g,交联时间16h,交联温度10℃,固定化酶酶活回收可达47·52%。固定化酶和游离酶的最适作用温度均为30℃,最适作用pH分别为9·0和10·0,相比游离酶,固定化酶可在更宽的温度和pH范围内发挥高活性,且其温度和pH稳定性得到显著提高。室温下经冷冻干燥的固定化酶贮存90d后活性基本保持不变,贮藏半衰期约为190d。以酪蛋白为底物,重复使用7次后酶活仍保留有79·2%,操作半衰期约为21次使用率。

海洋低温碱性蛋白酶亚慢性毒理学研究

应用大鼠经口、经皮肤亚慢性毒性试验 ,对海洋低温碱性蛋白酶毒理学进行研究。 12 0只Wistar大鼠 ,随机分为 6组 :对照组 ,海洋低温碱性蛋白酶 1.2 g/ kg(经口 ) ,1.2 g/ kg、0 .135g/ kg、0 .0 15g/ kg(经皮 )和 1.2 g/ kg(经皮追踪组 ) ,用药周期 90 d,追踪组增加 2 8d观察。记录和检测大鼠的一般状况和体质量增长、脏器系数、血常规、凝血时间、肝肾功、部分血液生化和离子浓度及病理检查。结果表明 ,海洋低温碱性蛋白酶各组 (经皮、经口 )大鼠的各项指标与对照组比较均未见明显异常 ( P均 >0 .0 5) ,提示大鼠能耐受长期给予 1.2 g/ kg(经皮、经口 )

海洋低温碱性蛋白酶的皮肤变态反应研究

利用酶工程技术制得的海洋低温碱性蛋白酶 ,主要用于加酶的洗涤剂 ,在室温下有较高的酶活力。为确保海洋低温碱性蛋白酶使用的安全性 ,并为其应用提供实验依据 ,本文以豚鼠为受试动物 ,进行皮肤致敏反应试验。结果表明 ,经致敏接触和激发接触 ,2 ,4 -二硝基氯苯组 ( DNCB)皮肤最大平均反应值为 3.3,致敏率为 10 0 %。海洋低温碱性蛋白酶组皮肤最大平均反应值为 0 .0 5,致敏率为5%。

黄海黄杆菌YS-9412-130低温碱性蛋白酶的基因克隆和序列测定

黄海黄杆菌 YS- 94 12 - 130具有稳定的分泌低温碱性蛋白酶的能力。将其染色体 DNA用 Sau3A 部分酶切后 ,低熔点琼脂糖回收 2 - 10 Kb的 DNA片段 ,用 Klenow大片段酶半补齐 ,与用 Sal 酶切且半补齐的质粒 p UC19连接后 ,转化 E.Coli.JM10 9,构建基因文库。用酪蛋白平板法和酶联免疫吸附 ( EL ISA)的活性筛选方法从基因文库中筛选到一株产海洋低温碱性酶的阳性克隆 (命名为p HH1)。序列测定分析表明 ,此重组质粒包含有长度为 768bp低温碱性蛋白酶基因的完整的开放读码框架 ( ORF)和上游基因调控序列。此片段编码由 2 56个氨基酸组成的酶 ,计算分子量为 330 0 0 Dal。通过 Southern杂交证实了此片段来自于黄海黄杆菌 YS- 94 12 - 130基因组 DNA。

海洋低温碱性蛋白酶的遗传毒理学研究

应用 NIH纯系小鼠骨髓细胞微核试验和染色体畸变试验 ,探究海洋低温碱性蛋白酶的遗传毒性作用及对人类的潜在危害。观察并计数嗜多染红细胞 ( PCE)与正红细胞 ( NRBC)的比值、微核率 ;染色体的畸变类型和畸变率 ,检测海洋低温碱性蛋白酶的诱变作用。结果表明 ,皮下注射环磷酰胺的小鼠 ,P/ N比值 <1,微核率为 2 2 .97‰ ,染色体畸变率为 18.32 % ,与生理盐水 ( NS)对照组比较差异极显著 ( P<0 .0 1) ,而海洋低温碱性蛋白酶各组小鼠微核率均 <4‰ ,染色体畸变率为 0 .19%～0 .2 5% ,与 NS组比较无显著性差异 ( P>0 .0 5)。未见海洋低温碱性蛋白酶各组对小鼠骨髓细胞的遗传毒性。

黄海黄杆菌YS-9412-130低温碱性蛋白酶多克隆抗体的制备

利用纯化的黄海黄杆菌海洋低温碱性蛋白酶 ( Marine L ow- temperature Alkaline Protease,MLAP) ,采用背皮内多点注射和皮下组织注射免疫相结合的方法对新西兰白兔进行免疫 ,制备了多克隆抗体 ,并对多克隆抗体进行了纯化。用 EL ISA的方法对其效价检测表明 ,其效价为 12 80 0 0。作者所做的

黄海黄杆菌YS-9412-130低温碱性蛋白酶发酵过程动力学研究

应用自动控制发酵设备 ,对黄海黄杆菌 YS- 94 12 - 130碱性蛋白酶发酵动力学和工艺条件进行了研究。从基本的动力学概念和方程出发 ,通过分批发酵试验摸索了黄海黄杆菌 YS- 94 12 - 130生长与代谢的基本规律 ,证明了发酵过程中低温碱性蛋白酶的形成为生长部分关联型。采用补料分批培养方法限制生长基质浓度 ,确定其一系列参数值 。

南极深海沉积物中产低温脂肪酶菌株的筛选与基因克隆

在10℃恒温培养条件下,从第29次南极科学考察获得的南极深海沉积物样品中分离筛选到产脂肪酶细菌3株,产脂肪酶真菌1株,对其进行分子生物学鉴定,确定为假交替单胞菌属(Pseudoalteromonas arctica)、芽孢杆菌属(Bacillus pumilus)、Glaciecola sp.以及白冬孢酵母属(Leucosporidium sp.).通过测定各酶的最适反应温度,获得产低温脂肪酶芽孢杆菌XZ18,该菌所产脂肪酶最适反应温度为30℃,在0℃仍有部分活性.从NaCl浓度和pH值2个条件对产酶条件进行研究,最终确定了该菌最适产酶NaCl浓度5.0%、最适产酶pH值为6,最高产酶量为4.65 U/cm3.通过PCR扩增,获得了脂肪酶全长序列,对该序列进行系统发育分析,发现该脂肪酶基因处于较独立的分支.

低温海洋微生物产碱性蛋白酶菌株的筛选

从连云港黄海海域的鱼类、贝类和海水等样品中分离到近150株产碱性蛋白酶的低温菌。并通过正交试验确定菌株的最佳培养基为干酪素平板培养基,水解酪蛋白试验可对菌株的产酶情况进行定性研究,酶活较高的菌株都能产生较大的水解圈。干酪素分离培养基配合水解酪蛋白试验,可以提高产碱性蛋白酶菌株筛选效率。对其中3株产酶活性较高的菌株(ASG,YSG,ZG)进行了耐盐性试验和培养温度试验,菌株ASG,YSG的最适生长温度、时间以及培养基的最适ω(NaCl)分别为:15℃,36 h,5％;20℃,30 h,3％。

YS-80-122海洋低温碱性蛋白酶的性质

碱性蛋白酶是一种最重要的工业用酶 ,广泛应用于洗涤、食品、皮革和丝绸行业。海洋低温碱性蛋白酶是一种应用我国海洋嗜极微生物黄海黄杆菌 (YS - 80 - 12 2 )代谢产物并通过现代生物工程手段开发出的一类新型酶。通过 6 0 0 0转 /分离心 (4℃ ) ,收集 (30 % - 6 5 % )硫酸铵沉淀 ,透析后等电聚焦制备分离 (12W) ,并经凝胶S - 2 0 0过滤 ,获得纯品经SDS -PAGE聚丙烯酰胺凝胶和C8HPLC图谱已达到电泳纯。其分子量为 4 9,32 0Dal,等电点为 8.5。建立酶活—温度—pH方程与模型 (r2 >0 .9) ,可求出其最适温度为 30℃ ,最适 pH为 9.5 ,低温 (T≤30℃ )和低 pH(pH≤ 8)对保持其稳定性有利。经试验该酶与大多数金属离子和增稠剂及表面活性剂适应性良好。Pb2 +、Ag+、Cu2 +对其有抑制作用 ,EDTA对其有强烈抑制作用。该酶性质与以往发现碱性蛋白酶性质不同 ,属于一种新型海洋酶。

酸碱耐受低温碱性脂肪酶产酶条件优化及其酶学性质

以沙雷氏菌JXJ-7为供试菌株,采用单因素试验确定了其最适发酵培养基配方、最佳胞外产酶条件,并对其粗酶酶学性质进行了研究。结果表明:该菌株的最佳发酵培养基为葡萄糖3.750 g/L、牛肉浸膏8.75 g/L、K2HPO4 2 g/L、菜籽油乳化液体积分数1.75%,初始pH值9;最佳发酵条件为培养温度30℃、装样量20 mL/250 mL、接种量1.0%、发酵时间28 h;沙雷氏菌JXJ-7所产胞外脂肪酶粗酶最适底物为对硝基苯酚辛酸脂,在10～35℃的温度范围内具有较高的酶活力,其中35℃时酶活力最高,但热稳定性较差;该酶具有良好的酸碱耐受性,pH值为9.5～10.5时酶活力较高;酶样品受到供试金属离子的抑制,在供试有机溶剂中具有良好的耐受性,对供试表面活性剂有一定的耐受性。总之,JXJ-7脂肪酶为低温碱性脂肪酶,在低温碱性环境的工业领域中有一定的应用潜力。