白背飞虱、灰飞虱mariner转座子的初步研究

根据毛里塔尼亚果蝇Drosophilamauritania的mariner转座子序列设计简并引物 ,以白背飞虱Sogatellafurcifera和灰飞虱Laodelphaxstriatellus基因组DNA为模板 ,通过PCR反应扩增出了约 5 0 0bp的条带 ,经回收、克隆、测序 ,获得其核苷酸序列 ,与毛里塔尼亚果蝇mariner序列相比 ,核苷酸同源性均为 71 3%,氨基酸同源性分别为 6 9 5 %和 72 %,证明白背飞虱和灰飞虱体内确实存在mariner转座子。

Tc1/Mariner转座子超家族的研究进展

随着高通量测序技术的迅猛发展,越来越多的生物基因组注释结果表明:转座子几乎存在于所有生物的基因组中,是大多数生物基因组的重要组分。其中,Tc1/Mariner转座子是自然界中分布最广泛的一类DNA转座子超家族,在自然界已经发现14个有活性的Tc1/Mariner转座子(如Minos,Mos1等),另外通过分子重构也获得高活性的人工转座子,如睡美人转座子(Sleeping Beauty,SB)。SB和Mos1等转座子作为基因转移载体已被广泛应用于转基因、基因捕获和基因治疗等领域的研究中,并取得了很好的应用效果。本文将重点综述Tc1/Mariner转座子的结构、分类、分布、转座机制、活性转座子的挖掘,及其在转基因、基因捕获和基因治疗等研究领域的应用。

Mariner转座子与小菜蛾抗性关系的研究

以抗溴氰菊酯、杀虫双、杀螟丹小菜蛾种群及其敏感品系为研究对象,借助聚合酶链式反应(PCR)、载体筛选、琼脂糖凝胶电泳等实验技术,检测了小菜蛾4个品系的Mariner转座子的存在及其与抗性的关系。结果表明,在抗溴氰菊酯、杀虫双、杀螟丹以及敏感品系的小菜蛾中都存在两种大约500 bp的Mariner转座子片断,初次证明在小菜蛾4个品系中均含有两种Mariner转座子,并发现一种新的转座子基因片断,但是没有发现Mariner转座子与抗性之间存在直接的联系。研究结果将为利用Mariner转座子标签法在小菜蛾中分离定位基因、转化外源基因、转基因昆虫防治害虫等研究提供理论基础。

mariner转座子及其在昆虫种系转化中的应用

转座子是不需要同源重组便能在基因组内和基因组间移动的遗传学顺式元件。mari-ner是最简单的真核转座子,在昆虫中广泛分布。mariner转座子的转座作用只与转座酶有关,是一种很有发展前景的转基因载体,可以实现异源昆虫间的基因转移,产生稳定遗传的转基因品系。

家蚕类mariner转座子相关序列分析

通过PCR克隆,从家蚕基因组中获得大小为975bp的DNA片段(登录号:EU352872),Blast搜寻结果显示,该片段DNA序列的52-449nt区域与野蚕mariner-like元件DNA(登录号:AB237562)的同源性达90%,推测为家蚕类mariner转座子相关序列,在乙酰胆碱酯酶基因的第5内含子、微卫星S1104-R序列、BmBRC-NZ3 mRNA终止码的下游序列、ErB·1基因的内含子均检测到家蚕类mariner元件相关序列的同源区,暗示家蚕类mariner元件在家蚕基因组中发生了多次转座,并在家蚕基因组的不同区域随着进化发生了歧化。

Tc1/Mariner转座子超家族在褶皱臂尾轮虫中的进化和表达分析

为了探究Tc1/Mariner转座子超家族对褶皱臂尾轮虫(Brachionus plicatilis)基因组结构和基因表达调控的影响,本研究基于褶皱臂尾轮虫的基因组和转录组数据,对褶皱臂尾轮虫的重复序列进行了注释,并对褶皱臂尾轮虫的转座子的表达和其临近基因的表达进行了统计和富集,在基因上下游及内部区域富集到了10个转座子家族(其中3个家族属于Tc1/Mariner超家族)。在针对褶皱臂尾轮虫的Tc1/Mariner超家族分析中,共发现其7个亚家族:Tc1(DD34E)、Tc2(DD35D)、Mariner(DD34D)、Pogo(DDxD)、Sagan(DD30D)、Tigger(DD32/36D)和Fot1(DD30D),并主要分布在基因间区,对转座酶催化区域的结构和系统发育分析显示拥有完整转座酶的3个亚家族(Tc1、Tc2和Pogo)保守性强且聚类情况良好。基于转录组数据发现各个家族的表达模式较为相似,在雄性阶段表达较高。Tc1/Mariner超家族临近基因的功能大量涉及到环境信息处理和生物发育调节,反映了褶皱臂尾轮虫基因组对环境的适应。本研究通过对褶皱臂尾轮虫Tc1/Mariner转座子超家族在基因组中的进化和表达进行系统分析,为从功能角度认知Tc1/Mariner转座子并理解Tc1/Mariner对基因组进化的作用提供了新的线索。

玉米非自主性转座子rDt的体细胞转座序列特征

Dotted/rDt是玉米遗传学中最早发现的双元转座子系统之一。为了揭示玉米中非自主性转座子rDt在其自主性转座子Dt调控下的转座遗传特性,选取了a1-rDt;Dt和a1-m1::rDt;Dt2个rDt转座子插入突变等位基因,检测玉米籽粒紫色斑点表型差异的遗传基础,利用巢式PCR与特异性酶切相结合的方法检测并鉴定了这2种材料叶片组织中rDt体细胞转座的印迹序列类型。通过构建遗传杂交群体,统计分析各群体的后代籽粒表型以及A1野生型基因的回复突变频率。结果显示,在籽粒糊粉层紫色斑点大小均一但数目极低的a1-rDt;Dt材料中,仅检测到2种体细胞转座的印迹序列类型,其中1种是没有转座子插入前A1野生型。而在籽粒糊粉层紫色斑点大小不一、排列密集的a1-m1::rDt;Dt材料中可以检测到5种体细胞转座的印迹序列类型,其中3种类型均保持A1'回复突变基因的开放阅读框;同时,a1-m1::rDt;Dt材料中A1'的回复突变频率是a1-rDt;Dt材料的大约2.6倍。研究表明,rDt在a1插入位点体细胞转座后的修复产物序列组成相对简单,与Ac/Ds等hAT超家族转座子相似,且rDt体细胞转座产生的印迹序列类型及丰富度是两个a1基因插入突变体中A1'回复突变频率高低及玉米籽粒糊粉层表型差异的遗传基础。

干旱条件下玉米转座子插入关联的表观调控分析

【目的】干旱是全球范围影响玉米生产的最主要胁迫因素之一。解析抗旱性的遗传基础与分子机制为玉米的抗旱改良提供依据。【方法】利用代表性玉米自交系,以叶片相对含水量和散粉-吐丝间隔为指标开展田间抗旱性精准鉴定。筛选2个抗旱性极端差异的自交系,开展基因组重测序分析和转座子插入鉴定;利用全基因组重亚硫酸盐测序(WGBS)方法分析不同水分处理下叶片和根系组织的DNA甲基化水平;同时利用转录组测序方法对相同样品的基因表达进行分析;通过比较分析获得2个材料间的转座子插入缺失变异、差异甲基化区域和差异表达基因,并综合分析这三者间的相关关系。针对前期克隆的玉米抗旱基因ZCN7,分析该基因区域转座子插入缺失变异介导的DNA甲基化和基因表达变化情况。【结果】在田间干旱处理下,自交系H082183的叶片相对含水量和散粉-吐丝间隔均与正常处理没有显著差异,而旅28在所有试验材料中表现最低的叶片相对含水量和最大的散粉-吐丝间隔。利用H082183和旅28这两个抗旱性极端差异的玉米自交系开展基因组重测序和转座子插入分析,分别检测到333754和333296个转座子插入,其中,有89954个转座子插入在2个自交系间具有多态性。基因组DNA甲基化分析表明,转座子、内含子和启动子区域较外显子和非编码区呈现较高的CG和CHG甲基化水平,经差异甲基化分析,在2个自交系间共检测到41352个差异甲基化区域,其中60%的差异甲基化区域位于转座子插入缺失变异的上下游5 kb范围内。基因表达水平与基因的CG和CHG甲基化水平负相关,在2个自交系干旱下的叶片和根系中分别鉴定到4196和3500个差异表达基因,其中19.5%和19.7%与差异甲基化区域关联。通过对抗旱相关基因ZCN7的研究,发现该基因34 kb区间内的3个LTR类转座子插入,造成自交系旅28在干旱和正常处理下的CG和CHG甲基化显著高于抗旱自交系H082183,并且H082183中ZCN7表达量也显著高于旅28。【结论】揭示了转座子介导的表观遗传调控在玉米响应干旱胁迫中的重要作用,进一步扩展了转座子变异和DNA甲基化调控抗旱基因ZCN7表达的分子机制。

酿酒酵母转座子介导外源基因的整合效率

为了比较分析酿酒酵母不同转座子对外源基因整合效率的影响,构建了转座子Ty1、Ty2和Ty4介导的G418表达盒及酿酒酵母BY4741重组菌BY-Ty1、BY-Ty2、BY-Ty4。研究发现,Ty2介导的整合型表达G418的BY4741重组菌转化平均菌落数为122,整合效率为93.33%,均高于Ty1和Ty4。Ty2介导的G418抗性重组菌BY-Ty2,比BY-Ty1和BY-Ty4对G418抗耐受性更强,基因拷贝数更高。结果表明,转座子Ty2更适合在酿酒酵母中介导外源基因整合。

DNA转座子异源活性的大规模调查揭示其功能多样性并扩展基因工程工具箱

自1948年美国科学家Barbara McClintock首次报道转座子以来[1],这类跳跃遗传元件对宿主演化的重要意义逐渐被揭示[2~5]。其中,DNA转座子作为主要类型之一,长期以来备受关注。然而,由于以往多为个案研究,DNA转座子活性的决定因素与进化模式的一般规律尚不清晰。尽管DNA转座子可作为基因工程工具用于插入诱变或转基因载体[6,7],但目前只有Sleeping Beauty(SB)等少数几种转座子得到了开发和广泛应用。因此,系统挖掘具有不同功能特点的转座子工具的工作亟待开展[8]。

IS200/IS605转座子家族编码的核酸酶OgeuIscB基因编辑体系的优化

目的提升来源于IS200/IS605转座子家族的RNA引导的核酸内切酶OgeuIscB的基因编辑效率。方法利用OgeuIscB蛋白已解析的晶体结构,计算氨基酸与核酸之间的原子距离,将距离小于10的非正电荷氨基酸残基突变为精氨酸(arginine,R)以提高OgeuIscB与核酸的亲和力,通过人胚肾293T细胞内源性位点验证不同突变体的基因编辑效率。结果经过两轮迭代突变,发现Q376R-S456R和A401R-S456R这2个双突变体在不同细胞系的多个内源性位点上均能显著提升OgeuIscB的基因编辑效率。结论基于结构对OgeuIscB蛋白进行理性蛋白质工程化改造,能够提升OgeuIscB核酸内切酶活性,为将其作为一种有效的基因编辑工具提供了实验依据。

Trigger转座子衍生蛋白1对肝癌细胞生长的影响

细胞周期失调是肿瘤重要的标志之一,生物信息学分析结果表明,Trigger转座子衍生蛋白1(TIGD1)在临床肝癌组织中高表达且与细胞周期相关,但相关机制未知。为了探究TIGD1调控肝癌细胞生长的具体机制,首先,利用shRNA质粒构建靶向敲低TIGD1的肝癌细胞系Hep3B,并分析TIGD1敲低对肝癌细胞生长的影响,结果表明细胞生长受阻;接着,通过细胞流式技术分析TIGD1敲低对肝癌细胞周期进程的影响,结果显示,TIGD1敲低的Hep3B细胞系的细胞周期进程主要阻滞于G2/M期;然后,通过免疫沉淀(IP)实验验证TIGD1可能发生相互结合的蛋白分子,结果表明,TIGD1可能与Aurora激酶相互作用蛋白1(AURKAIP1)存在相互结合,进一步的Co-IP实验证实了TIGD1和AURKAIP1之间的相互作用。已知AURKAIP1可调控Aurora激酶A(AURKA)的蛋白酶体降解途径,AURKA是一种有丝分裂调控蛋白,与细胞周期进程密切相关。文中进一步探究TIGD1对AURKA蛋白水平的影响,实验结果表明,在TIGD1敲低的情况下,AURKA在Hep3B细胞系中的蛋白水平明显下调,mRNA水平没有明显变化。综上所述,TIGD1可能通过调控AURKA在肝癌细胞中的转录后水平来影响细胞周期进程,从而影响肝癌的发生发展。

一种利用Tol2转座子快速获得牙鲆稳转细胞的方法

脂质体转染是分子生物学中研究基因功能和基因表达调控的常规手段。然而,在海水硬骨鱼细胞中,脂质体转染效率低下且很难通过转染后直接筛选的方式获得稳转细胞。本研究以pminiTol2为模板,在末端反向重复序列中间添加了CMV启动子、EGFP荧光蛋白、新霉素抗性基因等功能区域,构建了CMV-EGFP-pminiTol2重组载体。CMV-EGFP-pminiTol2和pCS-TP质粒经脂质体包裹共转染至牙鲆(Paralichthys olivaceus)卵巢颗粒细胞后,仅需2~3周的新霉素(G418)筛选即可获得稳定转染的细胞。本实验首次探究了利用Tol2转座子系统快速筛选获得牙鲆稳转细胞的方法,其研究成果可应用于牙鲆分子生物学研究,并为其他硬骨鱼类稳转细胞构建及筛选提供新思路。

mariner转座子pKKma的序列分析及转座性能

【目的】本研究针对携带mariner转座子的质粒pKKma,进行序列分析和功能注释。【方法】根据已知序列设计引物测定质粒序列。构建转座子突变文库,分析转座子转座效率。【结果】序列分析发现,质粒pKKma全长6879 bp,具有7个开放阅读框。其中,阅读框ORF6编码mariner转座酶(348 aa),属于mariner转座子Himar1转座酶的C9变种;pKKma有2个相同的27 bp的反向重复序列(inverted terminal repeats);阅读框ORF7为庆大霉素抗性基因aacC 1,位于转座子反向重复序列之间,与其它mariner转座子可转移序列比对发现,覆盖率仅为2.0%-47.7%,相应同源程度为3.2%-99.7%,可转移序列具有较大差异。转座效率分析显示,该转座子对于粘质沙雷氏菌的转座效率为(3.1×10-4)-(4.8×10-4),对于弗氏柠檬酸菌的转座效率为(1.3×10-3)-(1.7×10-3)。【结论】质粒pKKma携带一种新的mariner转座子,可在多种细菌中构建转座子文库,研究细菌基因的功能。

德氏乳杆菌与嗜热链球菌ISL3家族转座子的比较与分析

对存在于德氏乳杆菌(Lactobacillus delbrueckii)和嗜热链球菌(Lactobacillus delbrueckii)中的3类ISL3家族转座子进行了筛选和定位,确定了各自的反向重复序列(IRs)和其外部的正向重复序列(DRs).观察到3类转座子的IRs有部分相同(5’-GGCTCTATAATTT-3’//5’-TTGACAAAGAGCC-3’),碱基A和T丰富的8 bp的DRs中保守碱基均为第5位T.3类转座子中,转座酶之间约30%的相同性,与IRs的部分相同性以及对最保守碱基的识别有关.分析结果为后续进行相关的分子实验与研究或建立简单转座子的数据库打下基础.

V(D)J重排酶RAG与转座子及转座子基因编辑工具的关系

V(D)J重排是高等脊椎动物产生特异性抗体和受体的基础事件,是适应性免疫的特征,其关键酶重组激活基因(RAG)及V(D)J重排如何起源是免疫学中的一个基础问题。多种证据表明RAG和V(D)J重排可能起源于转座事件。本文就V(D)J重排酶RAG的功能,及其和原始RAG转座子的关系进行论述,同时思考RAG转座子和转座子基因编辑工具的联系,旨在为新型基因编辑工具研发和利用提供参考。

东亚飞蝗mariner转座子片段的克隆和序列分析

mariner转座子在昆虫中广泛存在,转座时不需要宿主特异因子的作用,是昆虫种系转化的有力工具.以mariner转座酶的保守序列设计的简并引物从东亚飞蝗Locusta migratoria manilensis(Meyen)基因组中扩增出7个序列有差异的片段,其中的1个片段能够翻译成为连续的氨基酸序列,另外6个片段中均含有终止子或移码突变.经同源性比对、序列特征分析,证实东亚飞蝗基因组中存在mariner类元件,但大部分都是无功能的假基因;系统进化分析发现东亚飞蝗基因组中的mariner类元件有可能属于新的mariner次级家族.

毛竹Mariner-like element自主转座子的鉴定与生物信息学分析

【目的】Mariner-like element(MLE)转座子是一类在真核生物基因组内广泛分布的DNA类转座子,以“剪切-黏贴”模式在基因组中复制扩张,可以作为一类高效稳定的工具应用于转基因、基因功能研究等领域。为了探究MLE转座子在毛竹基因组中的分布规律,揭示MLE转座子在毛竹进化过程中的演化模式,本研究对毛竹MLE转座子进行了全基因组挖掘和分析。【方法】基于水稻、大豆和毛竹目前发表的MLE转座子序列,利用IRF、Blast和Fasta等工具,根据MLE转座子序列的特异性结构末端倒置重复序列(TIR)及其所编码转座酶的保守性,对毛竹基因组中的MLE转座子进行挖掘,从毛竹基因组中筛选具有完整结构的MLE转座子。分析所获得的MLE转座子的结构特征,根据完整MLE转座子的转座调控元件,从毛竹基因组中筛选出所对应非自主转座子,通过序列提取和比对,对自主与非自主转座子的分布特点以及非自主转座子结构缺失特点进行分析。【结果】共鉴定了2个完整结构的自主MLE转座子,PhV2MLE1A和PhV2MLE2A。PhV2MLE1A全长3950 bp,编码414个氨基酸,TIR长度30 bp;PhV2MLE2A全长12990 bp,编码373个氨基酸,TIR长度49 bp。根据TIR结构的相似性,鉴定出2个自主MLE转座子所对应的非自主转座子,本试验共获得2个结构完整的自主MLE转座子,以及各自对应的非自主转座子,同时发现不同的非自主转座子的结构缺失情况并无规律。所鉴定到的MLE转座子在毛竹基因组中的分布存在随机性,在毛竹基因组中偏好插入保守序列TA之间。【结论】毛竹基因组中分布着大量的MLE转座子,其中绝大多数在进化过程中由于转座酶结构缺失,失去了转座活性。