Development of a Duplex Real-time PCR assay for Detection of Perkinsus and Marteilia refringens in Shellfish

[ Objective] To improve the accuracy and efficiency of the detection which used in Perkinsus sp and Marteilia refringens, and then short- en the detective cycle. [ Method] According to the gene sequence of Perkinsus sp and Marteilia refringens from gene bank, design two pairs of spe- cific primers and two TaqMan probes with different fluorophores labeled. Optimizing the reactive conditions and reagent concentration in order that establishing the duplex real-time PCR method for detecting Perkinsus sp and Marteilia refringens simultaneously. [ Result ] The sensitivity of the du- plex real-time PCR method which about Pertdnsus sp and Marteilia refringens is 40 template copies. After combine the templates of Perkinsus sp and Marteilia refringens with different concentrations, this method still could be detect this two protozoan efficiently and synchronously. [ Condudon] The es- tablished duplex real-time PCR method for detecting Perkinsus sp. and Marteilia refringens possesses lots of advantages, such as specific, sensitive, rapid, quantitative and reproducible, can be used for clinical detection of infection which was caused by Perkinsus sp. and Marteilia refringens.

贝类单孢子虫和折光马尔太虫二重PCR检测方法的建立

根据基因库中单孢子虫和折光马尔太虫的基因序列,分别设计了2对特异性引物,通过对二重PCR扩增条件的优化,研究建立了可同时检测鉴别这2种原虫的二重PCR。对同一样品中的单孢子虫和折光马尔太虫模板DNA进行扩增,得到2条大小与试验设计相符的244 bp(单孢子虫)和478 bp(折光马尔太虫)的特异性扩增带,而对派琴虫、嗜水气单胞菌、荧光假单胞菌、副溶血弧菌、溶藻弧菌、河弧菌和拟态弧菌等病原体的检测,结果均为阴性。敏感性试验表明,该技术最低能检测到10 pg的单孢子虫和折光马尔太虫DNA。

贝类折光马尔太虫荧光定量PCR检测方法的建立

根据基因库中折光马尔太虫的基因保守序列,设计合成了一对引物和一条TaqMan探针,建立检测折光马尔太虫的荧光定量PCR方法,将建立的荧光定量PCR检测方法与常规PCR检测对比,所建立的荧光定量PCR方法灵敏度可达40个拷贝/μl,比常规PCR灵敏度高100倍,对派琴虫、单孢子虫、嗜水气单胞菌、荧光假单胞菌、副溶血弧菌、溶藻弧菌、河弧菌和拟态弧菌等病原体的检测结果为阴性。结果显示研究建立的折光马尔太虫荧光定量PCR方法具有特异、敏感、快速、定量、重复性好等优点,可用于临床上折光马尔太虫感染的检测。

贝类派琴虫和折光马尔太虫二重荧光定量PCR方法的建立

根据基因库中派琴虫和折光马尔太虫基因序列,设计了两对特异性引物和两条用不同荧光基团标记的TaqMan探针。对反应条件和试剂浓度进行优化,建立了能够同时检测派琴虫和折光马尔太虫的二重荧光定量PCR方法。该方法对派琴虫和折光马尔太虫的检测敏感性达到40个模板拷贝数;对派琴虫和折光马尔太虫不同浓度模板进行组合,该方法仍可有效地同时检测出这二种原虫。研究建立的派琴虫和折光马尔太虫荧光定量PCR具有特异、敏感、快速、定量和重复性好等优点,可用于临床上派琴虫和折光马尔太虫感染的检测。

贝类单孢子虫和折光马尔太虫二重荧光定量PCR方法的建立

根据GenBank中单孢子虫和折光马尔太虫基因序列,用Primer Express2.0软件设计了两对引物和两条TaqMan探针。对反应条件和试剂浓度进行优化,建立了能够同时检测单孢子虫和折光马尔太虫的二重荧光定量PCR方法。该方法对单孢子虫和折光马尔太虫的检测敏感性达到40个模板拷贝数;此外抗干扰能力强,对单孢子虫和折光马尔太虫不同模板浓度进行组合,仍可有效地同时检测到这两个原虫。该方法对派琴虫、荧光假单胞菌、副溶血弧菌、溶藻弧菌、河弧菌和拟态弧菌等病原体的检测,结果全为阴性。研究建立的单孢子虫和折光马尔太虫荧光定量PCR具有特异、敏感、快速、定量、重复性好等优点,可用于贝类单孢子虫和折光马尔太虫感染的检测。

贝类折光马尔太虫PCR检测方法的建立

根据基因库中折光马尔太虫的基因保守序列,设计了1对特异性引物,通过对PCR扩增条件的优化,研究建立了检测贝类折光马尔太虫的PCR方法。该方法对折光马尔太虫模板进行扩增,得到与试验设计相符的478bp的特异性扩增带,而对派琴虫、单孢子虫、嗜水气单胞菌、荧光假单胞菌、副溶血弧菌、溶藻弧菌和河弧菌等病原体的扩增,结果全为阴性。敏感性试验结果表明,该技术最低能检测到1pg的折光马尔太虫DNA。用该PCR对广西沿海的119份牡蛎病料进行检测,折光马尔太虫的阳性率为1.68%,结果提示了中国南方沿海的养殖贝类中存在折光马尔太虫的感染,建立的PCR方法可以用于贝类折光马尔太虫的临床快速检测。

贝类派琴虫和折光马尔太虫二重PCR方法的建立

根据基因库中派琴虫和折光马尔太虫的基因序列,分别设计了二对特异性引物,通过对二重PCR扩增条件的优化,研究建立了可同时检测鉴别这二种原虫的多重PCR。该技术对同一样品中的派琴虫和折光马尔太虫模板进行扩增,结果均同时得到2条大小与实验设计相符的596bp(派琴虫)和478bp(折光马尔太虫)的特异性扩增带,而对单孢子虫、嗜水气单胞菌、荧光假单胞菌、副溶血弧菌、溶藻弧菌、河弧菌和拟态弧菌等病原体的扩增,结果全为阴性。敏感性试验结果表明,该技术最低能检测到10pg的派琴虫和折光马尔太虫DNA。用该二重PCR对广西沿海的119份牡蛎样品进行检测,结果派琴虫和折光马尔太虫的阳性率分别为9.24%和1.68%,提示了中国南方沿海的养殖贝类中存在派琴虫和折光马尔太虫的感染。

贝类折光马尔太虫荧光定量PCR检测方法的建立(英文)

[目的]建立贝类折光马尔太虫荧光定量PCR检测方法。[方法]根据基因库中折光马尔太虫的基因保守序列,设计合成了一对引物和一条TaqMan探针,建立检测折光马尔太虫的荧光定量PCR方法,将建立的荧光定量PCR检测方法与常规PCR检测对比。[结果]所建立的荧光定量PCR方法灵敏度可达40个拷贝/μl,比常规PCR灵敏度高100倍,对派琴虫、单孢子虫、嗜水气单胞菌、荧光假单胞菌、副溶血弧菌、溶藻弧菌、河弧菌和拟态弧菌等病原体的检测结果为阴性。[结论]研究建立的折光马尔太虫荧光定量PCR方法具有特异、敏感、快速、定量、重复性好等优点,可用于临床上折光马尔太虫感染的检测。

中国沿海主要养殖贝类四种原虫病流行病学的调查研究

为全面系统了解中国沿海主要养殖贝类4种原虫病的分布和流行状况,本研究从2006年10月到2012年10月的6年间,在中国主要贝类养殖海区采集牡蛎、文蛤和扇贝等11种养殖贝类331批共11291份,并对其四种原虫的感染情况进行检测和调查。结果显示,4种原虫的感染率累计为15.28%(1725/11291),其中感染率最高的为派琴虫(9.98%)(1127/11291),其次为尼氏单孢子虫(3.99%)(451/11291),最低为折光马尔太虫(1.30%)(147/11291),未检出包拉米虫的感染。在单个的牡蛎、花甲螺、菲律宾蛤仔、扇贝、溢蛏和血蛤中,存在多种原虫混合感染的现象,混合感染率为6.78%(117/1725),其它贝类均为单一感染,感染率为93.22%(1608/1725)。调查结果还表明,中国不同海域和不同品种的牡蛎,尼氏单孢子虫和派琴虫的感染率存在明显差异。该调查结果将为中国贝类养殖原虫病的防治提供重要的科学依据。

3种贝类原虫多重荧光定量PCR方法的建立

目的:建立能够同时检测单孢子虫、派琴虫和折光马尔太虫的三重荧光定量PCR方法。方法:根据基因库中单孢子虫、派琴虫和折光马尔太虫的基因序列,设计3对特异性引物和3条用不同荧光基团标记的TaqMan探针,对反应条件和试剂浓度进行优化,建立能够同时检测单孢子虫、派琴虫和折光马尔太虫的三重荧光定量PCR方法。结果:该方法对单孢子虫、派琴虫和折光马尔太虫的检测敏感性分别达到40、400和40个模板拷贝数;此外抗干扰能力强,对单孢子虫、派琴虫和折光马尔太虫不同模板浓度进行组合,仍可有效地同时检测这3种原虫,对嗜水气单胞菌、荧光假单胞菌、副溶血弧菌、溶藻弧菌、河弧菌和拟态弧菌等病原体的检测结果均为阴性。结论:建立的单孢子虫、派琴虫和折光马尔太虫多重荧光定量PCR具有特异、敏感、快速、定量和重复性好等优点,可用于临床上单孢子虫、派琴虫和折光马尔太虫感染的检测。

贝类折光马尔太虫半套式PCR检测方法的建立及初步应用

根据Genbank中折光马尔太虫的基因保守序列,设计了3条特异性引物,通过对半套式PCR扩增条件的优化,研究建立了检测贝类折光马尔太虫的半套式PCR方法。该方法对折光马尔太虫模板进行扩增,得到与实验设计相符的228bp的特异性扩增带,而对单孢子虫、派琴虫、副溶血弧菌、溶藻弧菌和河弧菌等病原体的扩增,结果全为阴性。敏感性试验结果表明,该技术最低能检测到0.01fg的折光马尔太虫质粒DNA。用该半套式PCR对福建沿海的贝类样品进行检测,结果从溢蛏中检出折光马尔太虫7份,结果提示福建沿海养殖的贝类中存在折光马尔太虫感染,建立的半套式PCR方法可以用于贝类折光马尔太虫的临床快速检测。

贝类折光马尔太虫LAMP可视化检测方法的建立

根据折光马尔太虫的基因保守序列设计了1套特异性环介导等温扩增(LAMP)引物,建立了折光马尔太虫LAMP可视化检测方法。该方法全部反应可在1h内完成;可通过肉眼观察颜色直接判定结果;检测的灵感性可达20fg,高于常规PCR方法100倍;对其他贝类常见病原体的检测结果均为阴性。结果表明,所建立的折光马尔太虫LAMP检测方法简便、快速、灵敏、特异,可用于贝类折光马尔太虫感染的快速检测。

贝类折光马尔太虫二温式PCR检测方法的建立及初步应用

根据GenBank中折光马尔太虫的基因保守序列,设计了一对特异性引物,通过对二温式PCR扩增条件的优化,建立了检测贝类折光马尔太虫的二温式PCR方法。该方法对折光马尔太虫模板进行扩增,得到与试验设计相符的266 bp的特异性扩增带,而对单孢子虫、派琴虫、副溶血弧菌、溶藻弧菌和河弧菌等病原体的扩增,结果全为阴性。敏感性试验结果表明,该技术最低能检测到1 fg的折光马尔太虫质粒DNA。用该二温式PCR对福建沿海的贝类样品进行检测,结果从溢蛏中检出折光马尔太虫12份,结果提示了福建沿海的养殖贝类中存在折光马尔太虫的感染,建立的二温式PCR方法可用于贝类折光马尔太虫的临床快速检测。