Mash-1转染对胚胎干细胞在小鼠脊髓损伤部位向神经细胞分化的促进作用

目的观察过表达Mash-1基因的胚胎干细胞在脊髓损伤部位向神经细胞分化的情况及其对脊髓神经损伤的修复作用。方法采用鼠干细胞病毒将Mash-1基因转染CE3小鼠胚胎干细胞稳转株。4周龄雄性SPF级昆明小鼠钳夹法建立急性脊髓损伤模型。造模后3 d向脊髓损伤部位注射生理盐水(模型组,n=12)、CE3胚胎干细胞(CE3组,n=12)、转染Mash-1基因的CE3小鼠胚胎干细胞(CE3-Mash-1组,n=12)。术后1 d、7 d、14 d、21 d、28 d检测小鼠后肢功能评分。术后14 d、28 d分别处死小鼠,HE染色观察脊髓剩余面积;CE3组、CE3-Mash-1组行Oct3/4、nestin、β-tubulinⅢ、神经胶质酸性蛋白(GFAP)免疫荧光染色,观察移植细胞的分化。结果与模型组比较,移植CE3和CE3-Mash-1细胞的小鼠运动功能均提高(F>84.471,P<0.05),脊髓剩余面积增加(F>49.990,P<0.05)。与移植CE3细胞相比,移植CE3-Mash-1细胞在损伤的脊髓部位Oct3/4阳性细胞数显著减少(t=5.439,P<0.001),而nestin(t=-7.536,P<0.001)和β-tubulinⅢ(t=-9.941,P<0.001)阳性细胞数显著增加,GFAP阳性细胞数无显著性差异(t=1.701,P=0.120)。结论过表达Mash-1基因可促进CE3细胞在脊髓损伤部位分化成神经元,促进小鼠后肢运动功能的恢复。

神经分化发育相关基因Mash-1的研究进展

Mash-1(mammalian achaete-scute homologue-1)含碱性螺旋-环-螺旋(basic helix-loop-helix,bHLH)结构域,能与E蛋白结合启动下游基因的转录。Mash-1在神经系统发育过程中是通过Notch介导的一系列信号来调控转录。Id竞争性地和E蛋白结合从而实现对Mash-1基因的负调控。Mash-1在中枢神经系统和周围神经系统发育中都有表达,Mash-1对神经元和神经胶质细胞的分化都有很重要的作用。因此,对Mash-1的进一步研究尤其是研究其对神经干细胞的分化调控机制具有潜在的临床应用价值。

Mash-1基因对神经干细胞分化与神经发育的影响研究进展

Mash-1基因属于碱性螺旋-环-螺旋基因(basic helix-loop-helex,bHLH)家族,其存在对于神经发育有重大影响作用,其作用机制同Hes基因及Notch通路有复杂而紧密的联系。Hes基因可以拮抗Mash-1基因表达,Notch通路可通过不同方式起调控二者作用。Mash-1对于神经干细胞分化和决定细胞命运以及神经发育具有重大作用。

Mash-1在大鼠SVZa神经干细胞迁移流的发育学表达

目的了解在大鼠脑发育过程中,mash-1在SVZa神经干细胞迁移流通路中三个不同脑区内的表达模式。方法用RT-PCR和免疫荧光染色的方法观察在胚胎14d(E14),出生后0d(P0),生后7d(P7)3个不同发育阶段大鼠SVZa、RMS、OB3个区域mash-1的表达情况。结果RT-PCR显示在大鼠脑发育过程中SVZa、RMS、OB三个区域mash-1的mRNA均有不同程度的表达,在出生前后(P0)表达最高;免疫组化显示在大鼠脑发育成熟过程中,mash-1表达水平呈现复杂的时空表达模式,在胚胎期SVZa神经干细胞迁移流通路中表达密集,P0时期在嗅球有较高的表达,P7以后mash-1的表达水平普遍下降。结论mash-1可能主要参与调节大鼠SVZa神经干细胞分化过程,对其迁移和增殖也可能具有积极影响。

脑缺血再灌注海马齿状回神经干细胞Mash-1的表达

背景:Mash-1在中枢神经系统和周围神经系统发育中都有表达,对神经元和神经胶质细胞的分化都有很重要的作用。目的:检测Mash-1在大鼠脑缺血再灌注海马组织神经干细胞中的表达及其变化。方法:建立大脑中动脉栓塞制作大鼠脑缺血再灌注模型。实验分为假手术组、缺血再灌注3,7,14,21,28d组。结果与结论:免疫组织化学检测结果,随着脑缺血再灌注第3天海马神经元BrdU阳性细胞明显增多,第7天达高峰,然后逐渐减少。Mash-1反应产物随脑缺血再灌注时间延长逐渐增多,第21天表达最强,以后表达逐渐减少。提示Mash-1呈时间依赖性表达,与神经干细胞增殖分化进程相吻合,说明其在神经干细胞晚期分化中起重要调控作用。

Mash-1基因过表达对脑创伤后C57BL/6成年雄性小鼠神经细胞增殖、分化及学习、记忆功能的影响

目的观察Mash-1基因过表达对脑创伤后C57BL/6成年雄性小鼠神经细胞增殖、分化及学习、记忆功能的影响。方法将160只健康成年雄性C57BL/6小鼠随机分为假手术组、单纯创伤组、阴性对照组和过表达组。利用重组腺病毒Ad5-mMash-1进行基因转染。于脑创伤前1 d和脑创伤后1 d、3 d、7 d、14 d采取RT-PCR检测Mash-1 mRNA水平,Western blotting检测Mash-1蛋白表达,水迷宫评价学习和记忆功能。采用免疫荧光法检测脑创伤后3 d和7 d神经细胞增殖情况。结果与假手术组比较,单纯创伤组与阴性对照组脑创伤后1 d、3 d、7 d和14 d Mash-1 mRNA相对表达量显著降低(P <0. 05～0. 01),过表达组脑创伤后1 d、3 d、7 d和14 d Mash-1 mRNA相对表达量显著升高(均P <0. 01)。过表达组脑创伤后1 d、3 d、7 d和14 d的Mash-1 mRNA相对表达量显著高于单纯创伤组与阴性对照组(均P <0. 05)。与假手术组比较,单纯创伤组脑创伤后1 d、7 d、14 d,阴性对照组和过表达组脑创伤后1 d、3 d、7 d、14 d时Mash-1蛋白相对表达量显著升高(P <0. 05～0. 01),单纯创伤组脑创伤后3 d Mash-1蛋白相对表达量显著降低(P <0. 05)。过表达组脑创伤后1 d、3 d、7 d、14 d的Mash-1蛋白相对表达量显著高于单纯创伤组及阴性对照组(均P <0. 05)。与假手术组比较,单纯创伤组脑创伤后3 d、7 d的Brd U阳性细胞数,脑创伤后3 d DCX阳性细胞数显著减少(P <0. 05～0. 01),过表达组显著增多(均P <0. 05)。过表达组脑创伤后3 d、7 d的Brd U阳性细胞数,脑创伤后3 d DCX阳性细胞数显著高于单纯创伤组(均P <0. 05)。单纯创伤组、阴性对照组和过表达组的脑创伤后1 d、3 d、7 d、14 d的逃避潜伏期差异无统计学意义(均P> 0. 05)。与假手术组比较,单纯创伤组、阴性对照组和过表达组脑创伤后1 d、3 d、7 d、14 d的逃避潜伏期均显著延长(均P <0. 05)。结论 Mash-1基因过表达增加脑创伤后成年C57BL/6小鼠海马齿状回和大脑皮质的神经细胞增殖和分化,但对其学习和记忆功能无影响。

过表达Mash-1-1基因促进小鼠胚胎干细胞向神经细胞分化的研究

目的探讨过表达Mash-1基因对小鼠胚胎干细胞(embryonic stem cells,ESC)向神经细胞分化的影响。方法采用病毒感染技术将MSCV-Mash-1基因、MSCV空载体感染至小鼠ESC(CE3细胞)(MSCV-Mash-1-CE3组、MSCV-CE3组),RT-PCR鉴定细胞Mash-1基因的表达情况;然后采用悬滴培养法使其形成拟胚体,再经神经培养液贴壁诱导分化。培养7、21 d于倒置相差显微镜下观察细胞形态改变;免疫荧光染色检测细胞贴壁后其神经干细胞和神经元标记蛋白巢蛋白(nestin)和β-微管蛋白Ⅲ(β-tubulinⅢ)的阳性率;实时荧光定量PCR检测诱导培养0、1、7、14、21 d时,细胞甲胎蛋白(α-fetal protein,AFP)(内胚层标记基因)、Brachyury(中胚层标记基因)、FGF-5(外胚层标记基因)、Oct3/4(ESC标记基因)、nestin(神经干细胞标记基因)和β-tubulinⅢ(神经元标记基因)表达情况。以正常CE3细胞作为对照(CE3组)。结果与MSCV-CE3组和CE3组比较,MSCVMash-1-CE3组细胞Mash-1基因表达明显升高。经神经培养液诱导培养7、21 d后,MSCV-Mash-1-CE3组可见许多细胞折光性增强,长出细长轴突,出现单极、双极或多极形态,呈神经干细胞和神经元细胞形态;MSCV-CE3组和CE3组仅能观察到少数细胞长出细长轴突。免疫荧光染色检测示MSCV-Mash-1-CE3组诱导分化7 d nestin阳性率和21 dβ-tubulinⅢ阳性率显著高于MSCV-CE3组及CE3组(P<0.05)。实时荧光定量PCR检测示,与CE3组及MSCV-CE3组比较,培养1 d后MSCV-Mash-1-CE3组Brachyury表达明显降低(P<0.05),FGF-5和nestin表达增高(P<0.05);7 d后β-tubulinⅢ表达亦显著增高(P<0.05);CE3组及MSCV-CE3组以上指标比较,差异均无统计学意义(P>0.05)。3组间各时间点AFP和Oct3/4表达比较,差异均无统计学意义(P>0.05)。结论过表达Mash-1基因能促进小鼠ESC向神经细胞方向分化。

过量表达Wnt-1基因诱导P19细胞的神经分化

Wnt-1基因在小鼠神经发育过程中起着重要作用。该基因在胚胎性癌细胞P19向神经分化过程中存在瞬时性表达。利用克隆到的Wnt－1基因转染P19细胞（Wnt－1／P19），可使细胞不经视黄酸（RA）诱导，自发向神经细胞方向分化。早期神经分化关键基因MASH-1在Wnt－1／P19细胞的神经分化过程中的表达，晚于RA诱导引起的P19细胞的分化过程。

脑源性神经营养因子对胎鼠神经干细胞向神经元方向分化的诱导

背景：神经元是中枢神经系统起主导功能的细胞，培养干细胞的最终目的是获得相应表型的神经元，从而促进中枢神经系统损伤的修复。但以往相关文献显示神经干细胞分化为神经元的比例不到30％。目的：以脑源性神经营养因子作为诱导分化剂，观察其对胎鼠源性神经干细胞向神经元方向分化的作用。设计、时间及地点：细胞学体外观察，于2006-06／2007-08在南京医科大学第一附属医院中心实验室完成。材料：清洁级孕14～17d的sD大鼠10只，诱导分化剂脑源性神经营养因子为Peprotech产品，胎牛血清为杭州四季青产品。方法：孕鼠处死后取出胚胎，剪碎后机械法体外分离培养神经干细胞，锥虫蓝染色计数，调整细胞密度为2×10^6，添加B27及碱性成纤维细胞生长因子，置于37℃、体积分数为0．05的CO2恒温箱中原代培养，待细胞克隆球明显增大、中央变瞎时传代扩增。将培养所得的干细胞克隆球分为2组，诱导组添加体积分数为0．01的胎牛血清＋20ug／L脑源性神经营养因子共培养，血清对照组仅添加体积分数为0．01的胎牛血清。主要观察指标：在倒置显微镜下观察细胞生长、贴壁和分化情况。诱导分化5d后，行神经元免疫组化鉴定，流式细胞仪检测神经元阳性细胞率。取原代培养未分化的神经干细胞及诱导分化3d的两组细胞，RT-PCR检测内源性bHLH基因MASH-1的表达。结果：原代培养可获得数十至数百个神经干细胞聚集在一起的神经克隆球，形态规则，立体感强；悬浮生长的克隆球经诱导分化后，逐渐失去其球状的立体外观，邻近克隆球发出的突起可相互连接，3d后即有神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞从克隆周围出现。培养的神经干细胞呈巢蛋白阳性表达，诱导分化后呈微管相关蛋白2阳性表达。与血清对照组比较，诱导组神经元阳性细胞率显著升高（x^2=16．0，P〈0．05）。与未分化的神经干细胞比较，诱导组、血清对照组细胞MASH，1的表达均明显升高，且前者升高幅度明显强于后者（F=21．7，P〈0．05）。结论：脑源性神经营养因子能促进神经干细胞向神经元方向分化，可能与内源性bHLH基因MASH-I的表达升高有关。

益气化瘀方联合干细胞移植促进脊髓损伤修复的实验研究

目的:观察益气化瘀方联合过表达Mash-1修饰的胚胎干细胞对小鼠脊髓损伤的修复作用。方法:采用钳夹法建立小鼠急性脊髓损伤模型,于造模后第3天将Mash-1修饰的胚胎干细胞移植到脊髓损伤部位,并给予益气化瘀方干预。通过观察小鼠的后肢功能评分、脊髓的剩余面积以及神经营养因子、炎症因子和凋亡相关基因的表达改变;并采用免疫荧光检测OCT3/4、nestin、β-tubulinⅢ、GFAP的阳性细胞数目,分析移植细胞在体内的存活和分化情况。结果:与模型组比较,益气化瘀方可减少炎症因子TNF-α和凋亡基因caspase-3的表达,轻微提高小鼠运动功能。与单纯干细胞移植组比较,益气化瘀方联合Mash-1修饰胚胎干细胞移植能减少炎症因子TNF-α的基因表达水平,提高移植细胞的存活数量,进而改善小鼠的后肢运动评分。结论:益气化瘀方能减轻脊髓损伤的炎症反应,增加移植细胞在脊髓损伤部位的存活数量,促进脊髓损伤的修复。

应用于MEMS陀螺中的Σ-Δ高通级联型调制器设计

研究并设计了一种应用于MEMS陀螺的Σ-Δ高通级联型调制器.该调制器基于0.35μm 3.3 V的现代CMOS工艺,选取了无条件稳定的1-1-1 MASH(Multi-stage noise Shaping,多级噪声整形)结构,采用了斩波稳零技术,消除运放1/f噪声和直流偏移.高通积分器的运用,优化了低频信号的传输抗干扰性.本设计中的调制器能够转换MEMS陀螺中带宽40 kHz,范围几十至几百毫伏的目标信号,电路采样时钟频率10.24 MHz,调制器动态范围超过100 dB,有效位数达到17位.