Aurora-A表达与胰腺癌吉西他滨耐药关系的实验研究

目的探讨Aurora-A的表达与胰腺癌吉西他滨耐药之间的关系。方法 40只裸鼠采用随机数字表法分为两组,分别采用人胰腺癌细胞株PANC-1和吉西他滨耐药株PANC-1/R2皮下移植再原位移植的方法构建动物模型(PANC-1组、PANC-1/R2组)。采用实时定量基因扩增(q PCR)法测定PANC-1和PANC-1/R2中Aurora-Am RNA的表达。建模后第5周处死裸鼠,测定并比较两组裸鼠体重、肿瘤转移情况、肿瘤质量;采用免疫组化方法测定并比较两组瘤体Aurora-A蛋白的表达。结果PANC-1组、PANC-1/R2组第5周裸鼠体重、肿瘤重量及肿瘤转移率分别为(23.2±1.41)g、(0.453±0.110)g、36.8%及(22.91±1.13)g、(0.564±0.203)g、50.0%,两组比较差异均有统计学意义(均P<0.05),两组Aurora-A m RNA表达分别为1.002±0.040及1.845±0.069,差异有统计学意义(P<0.05);两组Aurora-A蛋白阳性表达率分别为83.3%及57.9%,差异有统计学意义(P<0.05)。结论 Aurora-A高表达与胰腺癌细胞株的吉西他滨耐药有关,新方法构建的PANC-1/R2耐药株Aurora-A高表达,可用于胰腺癌吉西他滨耐药研究的载体。

Aurora-A在胰腺癌的表达及与吉西他滨耐药的相关性研究

目的探讨Aurora—A的表达与胰腺癌吉西他滨耐药的相关性。方法qPCR法测定PANC-1和耐药细胞株PANC．1／R2中Aurora-A mRNA的表达；分别用PANC．1和PANC．1／R2建立胰腺癌动物模型，免疫组化方法测定瘤体Aurora-A的表达。结果PANC-1组模型第5周肿瘤转移率36．8％（7／19），裸鼠体重（23．2±1．41）g，肿瘤重量（0．453±0．110）g；PANC-1／R2组模型第5周肿瘤转移率50％（9／18），裸鼠体重（22．91±1．13）g，肿瘤重量（0．564±0．203）g。转移率和肿瘤质量两组比较差异有统计学意义。PANC-1组Aurora-AmRNA表达为（1．002±0．040）；PANC—1／R2组Aurora-A mRNA表达为（1．845±0．069），两组比较差异有统计学意义（P〈0．05）。PANC-1／R2组18例标本组织中Aurora—A蛋白阳性表达15例（83.3％）；PANC-1组19例组织的Aurora—A蛋白检测阳性表达11例（57．9％），两组比较差异有统计学意义（P〈0．05）。结论Aurora-A基因高表达与胰腺癌细胞株的吉西他滨耐药有关，新方法构建的PANC-1／R2耐药株Aurora-A基因高表达，可用于胰腺癌吉西他滨耐药研究的载体。

苦参碱对胰腺癌吉西他滨耐药及Aurora—A表达的影响

目的探讨苦参碱对胰腺癌吉西他滨耐药及Aurora—A表达的影响。方法不同浓度苦参碱联合吉西他滨处理PANC-1及其耐药细胞株PANC-1／R2，流式细胞技术检测细胞株凋亡情况；qPCR法测定Aurora-A mRNA表达。结果流式细胞技术显示苦参碱和吉西他滨不同给药方式在PANC-1组和合PANC—1／R2组内凋亡率差异无统计学意义，但两组间比较差异有统计学意义。qPCR结果，PANC—1组在空白对照、吉西他滨（400μg／ml）、苦参碱（8mg／ml）及吉西他滨（400gg／ml）联合苦参碱（8μg／ml）处理后，Aurora—AmRNA表达分别是（1．001±0．041），（0．884±0．063），（0．884±0．063）和（0．957±0．084），与对照纽比较差异均无统计学意义（P〉0．05）；PANC—1／R2组分别是（1．835±0．072），（1．761±0．052），（1．879±0．068）和（1．910±0．086），与对照组比较差异无统计学意义（P〉0．05）。结论苦参碱与吉西他滨联合作用具有诱导胰腺癌细胞凋亡的抗肿瘤作用，但不能逆转胰腺癌吉西他滨耐药的作用，不能增加化疗敏感性，也不具有调节Aurora-A表达的作用。提示苦参碱可通过诱导凋亡途径发挥抗胰腺癌作用，但其作用不十分显著。

体内外循环筛选法构建新型的胰腺癌吉西他滨耐药模型

目的构建一种新型的更接近疾病规律的胰腺癌吉西他滨耐药细胞及动物模型。方法选择胰腺癌细胞株PANC-1通过体外细胞培养，裸鼠皮下成瘤后瘤块移植构建胰腺癌动物模型，腹腔吉西他滨化疗，选取瘤体最大的动物模型，获取瘤块。进行分离提取瘤体细胞进行培养，用于下一循环的动物模型构建，如此循环2次，获得耐药细胞株及动物模型。将原代细胞和耐药细胞分别进行体外及体内吉西他滨的耐药试验，分析验证耐药模型。通过微卫星序列测定鉴定耐药模型与亲代细胞的同源性。结果建立胰腺癌吉西他滨耐药的细胞及动物模型，第一循环原位移植成功率为73．3％，吉西他滨腹腔灌注后死亡率为18．2％，瘤体最大的5个均值为（1．76±O．87）g，远处转移率11．1％；第二循环原位移植成功率80％，吉西他滨腹腔灌注后死亡率为8．3％，瘤体最大的5个均值为（216±1．12）g，远处转移率363％。两循环比较，瘤体大小及远处转移率差异有统计学意义（P〈0．05）。将第2循环后培养的胰腺癌吉西他滨耐药命名为PANC—1／R2。在5μg／d1、10μg／dl和20μg／dl浓度的吉西他滨作用下PANC-1和PANC-1／1K2的抑制率分别是21．8％、37．1％、46．1％和12．6％、253％、36．8％。PANC-1和PANC—1／tk2裸鼠皮下移植后3周成瘤，吉西他滨240mg／kg腹腔注射，1次／周，共4次，35d后瘤体大小分别是（1．87±0．69）g和（2．09±0．71）g，差异有统计学意义（P〈0．05）。人类基因组微卫星D14S68、D18S69、D20S199检测结果显示，亲代胰腺癌细胞、吉西他滨耐药胰腺癌细胞三个位点微卫星扩增大小完全相同的片段，而荷瘤裸鼠胰腺组织没有扩增出相应的带型。结论应用体外细胞培养，体内化疗药物诱导的方法是可行的，该体系可用于各种耐药细胞的筛选，与原代细胞相比，筛选后的细胞明显耐药性增强。且构建的细胞株更符合机体多因素复杂环境下的耐药产生过程，是理想的耐药模型。且该方法构建的耐药细胞与亲代细胞具有相同的遗传住点，具有遗传同源性。但构建过程长，需要熟练和细致的操作，提高成功率，增加循环次数或可筛选更具耐药特性的细胞模型。

苦参碱对胰腺癌吉西他滨耐药细胞化疗敏感性的影响

目的探索苦参碱在胰腺癌吉西他滨(GEM)耐药中的作用,以期为恢复胰腺癌化疗敏感性提供新的治疗手段。方法选择胰腺癌细胞系AsPC-1,使用吉西他滨诱导构建胰腺癌吉西他滨耐药细胞株AsPC-1-GEM,通过CCK-8实验测试其耐药性,检测细胞活力分析苦参碱对胰腺癌吉西他滨耐药细胞株的作用;进一步通过RT-PCR和Western Blot检测耐药前后多药耐药蛋白2(ABCG2)的表达变化以及苦参碱对ABCG2的影响;利用裸鼠建立胰腺癌吉西他滨耐药细胞系异种移植模型,观察使用苦参碱治疗后肿瘤体积的变化;通过免疫组化检测苦参碱对ABCG2表达的影响。结果耐药细胞AsPC-1-GEM中ABCG2表达增高(P<0.01),苦参碱可有效降低耐药细胞ABCG2的表达(P<0.01),提高胰腺癌吉西他滨耐药细胞的敏感性(P<0.01)。体内实验进一步验证了苦参碱治疗可降低ABCG2的表达(P<0.01),并减缓肿瘤生长(P<0.01)。结论苦参碱通过降低ABCG2的表达,提高胰腺癌吉西他滨耐药细胞株的敏感性。