槟榔提取物通过上调Max蛋白对口腔鳞癌细胞迁移、侵袭的影响

目的 分析槟榔提取物通过上调MYC关联因子X(Max)蛋白对口腔鳞癌细胞迁移、侵袭的影响。方法 将口腔鳞癌细胞分为对照组、低浓度槟榔提取物(低浓度)组、中浓度槟榔提取物(中浓度)组、高浓度槟榔提取物(高浓度)组,体外培养CAL127人口腔鳞癌细胞。采用实时荧光定量聚合酶链反应(RT-qPCR)法测定Max相对表达量;通过进行划痕实验来检验胃癌细胞株的迁移能力;通过Transwell小室对口腔鳞癌细胞的侵袭个数进行观察;采用Western印迹测定血小板源性生长因子(PDGF)B、磷酸化血小板源性生长因子(p-PDGFR)β、细胞周期蛋白(Cyclin)D1蛋白相对表达量。结果 与低、中浓度组相比,高浓度组Max表达均明显升高,口腔鳞癌细胞迁移能力及侵袭个数均明显降低(P<0.05)。高浓度组口腔鳞癌细胞处于G0/G1期均明显高于对照组、低、中浓度组(P<0.05);高浓度组口腔鳞癌细胞处于S期均明显低于对照组、低、中浓度组(P<0.05);高浓度组口腔鳞癌细胞处于G2/M期明显低于对照组、低、中浓度组(P<0.05)。高浓度组口腔鳞癌细胞增殖率较对照组及低、中浓度组明显降低,凋亡率较对照组、低、中浓度组明显升高(P<0.05)。高浓度组口腔鳞癌细胞PDGFB、p-PDGFRβ、CyclinD1蛋白表达较对照组及低、中浓度组明显降低(P<0.05)。结论 槟榔提取物可能通过上调Max蛋白的表达而显著抑制口腔鳞癌细胞的迁移和侵袭。

毛蕊花苷通过上调Max蛋白抑制口腔鳞癌细胞的迁移和侵袭

目的:探讨毛蕊花苷对口腔鳞癌细胞迁移和侵袭的影响及其机制。方法:质谱分析空白对照组及毛蕊花苷处理组口腔鳞癌细胞HN4中蛋白的表达谱,筛选毛蕊花苷处理后丰度高且表达显著增加的蛋白,用Western blot验证质谱分析的结果,并在HN4细胞中运用shRNA干扰关键蛋白的表达,分析毛蕊花苷处理对HN4细胞迁移和侵袭的影响。结果:质谱分析结果显示经毛蕊花苷处理后,HN4细胞中Max、TMPRSS11F、ROBO4和AP4E1等18种蛋白表达显著升高(变化倍数>1.5),对其中改变最明显的Max蛋白进行Western blot检测,结果与质谱芯片结果一致;shRNA干扰HN4细胞中Max的表达,qRT-PCR和Western blot检测发现HN4细胞中Max的表达明显下调,运用毛蕊花苷刺激HN4细胞,发现毛蕊花苷可显著抑制HN4细胞的迁移和侵袭。然而,当敲减Max蛋白后,毛蕊花苷抑制HN4细胞迁移和侵袭的能力显著减弱。结论:毛蕊花苷可能通过增强口腔鳞癌细胞中Max的表达抑制口腔鳞癌细胞的迁移和侵袭。

MAX二聚化蛋白1基因rs12475412和rs7349311多态性与中国汉族人群缺血性脑卒中及其中医证候的相关性

目的探索MAX二聚化蛋白1(MXD1)基因rs12475412、rs7349311多态性与中国汉族人群缺血性脑卒中(IS)及其中医证候的相关性。方法选取2016年1月至2019年12月于广西中医药大学第一附属医院脑病科就诊的774例IS患者作为观察组,选取同期本院社区体检中心健康体检者或外科等科室病情较轻的外伤患者793例作为对照组。使用MassARRAY单核苷酸多态性技术进行基因分型检测,应用PLINK软件进行遗传关联分析统计。结果观察组与对照组rs12475412、rs7349311位点的基因型频率分布差异均无统计学意义(均P>0.05)。校正年龄后,MXD1基因rs12475412、rs7349311多态性与中国汉族女性IS患者血瘀证发生风险显著相关(rs12475412加性模型、显性模型、隐性模型的比值比分别为1.033、1.031、1.034,rs7349311显性模型、隐性模型的比值比分别为1.034、1.033,均P<0.05),并与气虚证发生风险显著相关(rs12475412加性模型、显性模型、隐性模型的比值比分别为1.036、1.036、1.036,rs7349311加性模型、显性模型、隐性模型的比值比分别为1.043、1.043、1.044,均P<0.05)。但MXD1基因rs12475412、rs7349311多态性与中国汉族男性IS各中医证候均无明显相关性(均P>0.05)。在校正年龄后,MXD1基因rs12475412、rs7349311多态性与中国汉族女性IS血瘀证和气虚证患者空腹血糖、D-二聚体、凝血酶时间水平显著相关(均P<0.05)。结论MXD1基因多态性可能通过参与调控血糖代谢、凝血功能而影响中国汉族女性IS血瘀证和气虚证的发生发展。

Max二聚化蛋白1(Mad1)真核表达载体的构建及其对胃癌细胞增殖和迁移能力的影响

目的:构建Max二聚化蛋白1(Max dimerization protein 1,Mad1)的真核表达载体,研究Mad1对胃癌细胞增殖和迁移能力的影响。方法:利用DNA重组技术将Mad1基因克隆至pEGFP-N1载体,构建重组真核表达载体pEGFP-N1-Mad1。经酶切和测序鉴定后,采用脂质体转染技术将重组质粒瞬时转染人胃癌AGS细胞,RT-PCR及Western blot检测Mad1基因和蛋白的表达。荧光显微镜观察Mad1在AGS细胞内的定位情况。CCK-8和Transwell实验研究Mad1对胃癌AGS细胞增殖和迁移能力的影响。结果:成功构建携带Mad1基因的真核表达载体pEGFP-N1-Mad1。将重组质粒瞬时转染AGS细胞后,RT-PCR和Western blot检测到Mad1基因和蛋白的表达。Mad1基因表达产物定位于AGS细胞核中。CCK-8和Transwell实验结果显示,转染Mad1的AGS细胞与转染空载体的AGS细胞及正常AGS细胞相比,细胞增殖活力和迁移能力明显降低。结论:成功构建了真核表达载体p EGFP-N1-Mad1,研究表明Mad1可以抑制胃癌AGS细胞的增殖和迁移。

Max作用蛋白1-0缺失突变体的构建、表达及细胞内定位的研究

目的:构建Max作用蛋白1-0(Max interacting protein1-0,Mxi1-0)缺失突变体的真核表达载体并观察这些突变体在细胞内的定位情况,为研究Mxi1-0细胞内定位与其功能的关系奠定基础。方法:以野生型Mxi1-0真核表达质粒为模板,聚合酶链式反应扩增出5种类型Mxi1-0缺失突变体的基因片段,克隆至增强绿色荧光蛋白真核表达载体,经酶切和测序鉴定后,利用脂质体将重组质粒转染小鼠胚胎成纤维细胞株(NIH3T3)。Western blot检测融合蛋白的表达,荧光显微镜下观察融合蛋白细胞内定位情况。结果:各种Mxi1-0缺失突变体经测序鉴定正确后,在NIH3T3中得到表达。免疫荧光结果表明,脯氨酸富集结构域(PRD)突变体在细胞质和细胞核中均有分布,与Sin3结合域高度同源结构域(t SID)突变体主要分布于细胞质,在细胞核中有少量分布;PRD-t SID突变体及△PRD突变体分布于细胞质,而△PRD-t SID突变体主要分布于细胞核。结论:成功构建了5种人Mxi1-0缺失突变体的真核表达载体,并初步观察这些突变体在细胞内的定位情况,为探寻Mxi1-0在细胞内定位机制及功能奠定了基础。

Max作用蛋白1-0在氧糖剥夺诱导SH-SY5Y细胞凋亡中的作用

目的:探讨Max作用蛋白1-0(max action protein 1-0,Mxi1-0)在氧糖剥夺(oxygen-glucose deprivation,OGD)诱导SH-SY5Y细胞凋亡中的作用。方法:利用Western blot检测SH-SY5Y细胞在OGD条件下Mxi1-0和线粒体自噬相关蛋白LC3-Ⅱ、p62、Tom20的表达水平。Mxi1-0 siRNA转染SH-SY5Y细胞,以CCK-8法和Annexin V/PI染色法检测Mxi1-0在OGD诱导细胞凋亡中的作用。结果:OGD条件下,SH-SY5Y细胞中Mxi1-0的表达先上升后下降。OGD处理使线粒体自噬相关蛋白LC3-Ⅱ表达升高,p62和Tom20蛋白表达下降。OGD条件下,Mxi1-0沉默可抑制OGD诱导的线粒体自噬,增强OGD诱导的SH-SY5Y细胞凋亡。结论:Mxi1-0通过增强线粒体自噬拮抗OGD诱导的SH-SY5Y细胞凋亡。

过表达Mxi1对人胃癌SGC-7901细胞增殖和凋亡的影响

目的:构建含有Max结合蛋白1(Mxi1)基因的重组慢病毒载体,并探讨过表达Mxi1基因对人胃癌SGC-7901细胞增殖和凋亡的影响。方法:利用DNA重组技术将Mxi1基因克隆至慢病毒载体,经酶切和测序鉴定后,将重组质粒与慢病毒辅助包装元件质粒共转染293T细胞,获得含Mxi1基因的重组慢病毒。重组慢病毒感染人胃癌SGC-7901细胞,荧光显微镜下观察感染效率,逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测Mxi1、cyclinB1和caspase-8的基因表达,免疫印迹法(Western blot)检测Mxi1蛋白的表达。CCK-8比色法和流式细胞术分别检测Mxi1基因对人胃癌SGC-7901细胞增殖和凋亡的影响。结果:成功构建含Mxi1基因的慢病毒表达载体,RT-PCR和Western blot检测到Mxi1基因和蛋白的表达。RT-PCR结果显示,过表达Mxi1的SGC-7901细胞与空白对照细胞及过表达空病毒对照细胞相比,细胞内cyclinB1的mRNA表达水平明显降低,而caspase-8的mRNA表达水平显著升高。CCK-8实验和流式细胞术检测结果显示,过表达Mxi1的SGC-7901细胞与空白对照细胞及过表达空病毒对照细胞相比,细胞增殖活性明显降低,细胞凋亡率显著升高。结论:成功构建Mxi1慢病毒载体且有效转染SGC-7901细胞,过表达Mxi1可以抑制胃癌细胞增殖并促进其凋亡。

pEGFP-N1-Mxi1-0重组质粒的构建与表达

目的:构建Max作用蛋白1-0(Max interacting protein1-0,Mxi1-0)的真核表达载体,在小鼠胚胎成纤维细胞(NIH/3T3)中表达,以期为深入研究Mxi1-0的作用及机制奠定基础。方法:通过RT-PCR方法从人肿瘤细胞Hep G2中获得Mxi1-0基因的编码片段,连接至增强绿色荧光蛋白真核表达载体(p EGFP-N1)构建成p EGFP-N1-Mxi1-0。经酶切和测序鉴定重组质粒的正确性;采用脂质体转染技术将重组质粒瞬时转染NIH/3T3细胞,经荧光显微镜观察和Western blot方法检测Mxi1-0表达,免疫荧光法检测Mxi1-0在NIH/3T3细胞内的定位情况。结果:经双酶切和核酸序列测序鉴定证实含Mxi1-0的重组真核表达载体p EGFP-Mxi1-0构建成功。重组质粒瞬时转染NIH/3T3细胞后,检测到Mxi1-0的成功表达,并证实Mxi1-0主要定位于NIH/3T3细胞质中。结论:成功构建了真核表达载体p EGFP-N1-Mxi1-0,并检测到Mxi1-0的表达,实验证明Mxi1-0定位于NIH/3T3细胞质中。

ChREBP和Mlx在调控葡萄糖反应基因表达中的作用

近年的研究结果显示,葡萄糖能在转录水平调控糖酵解和生脂酶基因的表达,对肝糖类和脂类动态平衡起协同调控作用.其重要转录因子是糖反应元件结合蛋白(ChREBP)和Max样蛋白X(Mlx),葡萄糖通过ChREBP.Mlx异二聚体调控葡萄糖反应基因的转录.本文主要综述转录因子ChREBP和Mlx的结构与功能,调控葡萄糖反应基因表达的机制,以及影响转录因子表达的因素.

DNA甲基转移酶3A、MAX基因关联蛋白A、磷酯酰肌醇-3激酶催化亚基γ基因基因突变与老年非小细胞肺癌患者预后的关系

目的:探讨DNA甲基转移酶3A(DNMT3A)、MAX基因关联蛋白A(MGA)、磷酯酰肌醇-3激酶催化亚基γ基因(PIK3CG)基因突变与老年非小细胞肺癌患者预后的关系。方法:选择2014年3月至2017年3月收治的468例非小细胞肺癌患者,采用扩增阻滞突变系统(ARMS)检测其癌组织中DNMT3A、MGA、PIK3CG基因突变,分析DNMT3A、MGA、PIK3CG基因突变与临床病理特征及预后的相关性。结果:468例非小细胞肺癌患者中,DNMT3A基因突变阳性37例(7.91%),MGA基因突变阳性25例(5.34%),PIK3CG基因突变阳性19例(4.06%);年龄、性别、吸烟情况、肿瘤直径、病理类型不同的非小细胞肺癌患者DNMT3A、MGA、PIK3CG基因突变率差异无统计学意义(P>0.05);淋巴结转移、临床分期不同的非小细胞肺癌患者DNMT3A、MGA、PIK3CG基因突变率差异有统计学意义(P<0.05);DNMT3A、MGA、PIK3CG基因突变阳性的非小细胞肺癌患者OS、PFS显著低于DNMT3A、MGA、PIK3CG基因突变阴性的非小细胞肺癌患者(P<0.05)。结论:DNMT3A、MGA、PIK3CG基因突变与老年非小细胞肺癌患者淋巴结转移、临床分期及预后明显相关,发生淋巴结转移、临床分期较高、预后较差的老年非小细胞肺癌患者DNMT3A、MGA、PIK3CG基因突变率越高。

大豆胰蛋白酶抑制剂Bowman-Birk基因家族新等位变异分析

大豆胰蛋白酶抑制剂主要有Kunitz型胰蛋白酶抑制剂(KTi)和Bowman-Birk型胰蛋白酶抑制剂(BBI).BBI家族已经克隆的有BBI-A,BBI-C和BBI-D三类抑制剂,而KTi型家族包含有Tia,Tib,Tic,Tid,Tie,Tif,Tis和ti共8个多基因共显性控制单位点的多态类型及KTi1/2,KTi3等成员.本研究对大豆品种"绥农14"鼓粒期籽粒cDNA文库随机测序,组装出的175个contigs(或singletons),大豆胰蛋白酶抑制剂有关的contigs有17个,其中12个序列组装成的4个contigs,如contig5,contig35,contig8和contig9分别与BBI家族成员BBI-A1,BBI-A2,BBI-C和BBI-D有关,序列之间的相似性达到98%以上,均包含完整的可读框(ORF),并且存在新的等位变异,通过cDNA和基因组PCR扩增,克隆了BBI家族4个成员,证实了新等位变异的存在.通过比较分析籽粒形成时期的cDNA文库,发现大豆胰蛋白酶抑制剂基因表达随籽粒的发育和成熟而呈现由低到高变化趋势.大豆、水稻、花生、玉米和豇豆的Bowman-Birk蛋白酶抑制剂基因的序列聚类分析,表明禾谷类和豆科植物BBI家族具有共同的祖先.

MXD3表达水平与前列腺癌患者预后和免疫浸润的相关性研究

目的 探究MAX二聚化蛋白3(MXD3)在前列腺癌中的表达及与患者预后和免疫浸润的相关性。方法从TCGA数据库获取前列腺癌样本和正常样本的RNA测序数据和临床信息,比较肿瘤和相邻正常组织之间的MXD3表达水平。进行Kaplan-Meier生存分析,评估MXD3表达水平的预后价值和MXD3和临床特征之间的关联。采用GO和KEGG进行基因富集分析,使用ESTIMATE算法分析前列腺癌中MXD3表达与免疫细胞浸润之间的相关性。通过qRT-PCR和蛋白质印迹验证前列腺癌组织中的MXD3 mRNA和蛋白质表达水平。结果MXD3的表达水平在前列腺癌中显著高于正常前列腺组织,其高表达与不良预后显著相关,而且MXD3表达水平与肿瘤的临床分期呈正相关(P<0.05或P<0.001)。GO功能和KEGG通路富集分析结果显示MXD3与前列腺癌细胞的分裂增殖密切相关。MXD3的表达与调节性T细胞和滤泡辅助T细胞的免疫细胞浸润水平呈正相关(P<0.001和P<0.05),而与肥大细胞和CD4^(+)T细胞呈负相关(P<0.01和P<0.001)。与癌旁正常组织相比,MXD3在前列腺癌中mRNA和蛋白质表达显著增加(P<0.01)。结论 MXD3在前列腺癌中高表达,与前列腺癌患者不良预后有关,参与前列腺癌的分裂增殖并与免疫浸润相关,是潜在的预后生物标志物和免疫靶点。

白血病细胞株KG1中Mxi1突变基因真核表达载体的构建

目的构建Max结合蛋白1(Max interacting protein 1,Mxi1)基因的野生型和突变型真核表达载体,观察表达载体转染真核细胞后蛋白表达的情况。方法将正常人和白血病细胞株KG1细胞的Mxi1野生型/突变型基因cDNA插入到红色荧光蛋白质粒pDs-red2-N1中,构建为pDs-red2-N1/Mxi1(野生型/突变型)真核表达载体;采用脂质体方法将质粒转染Cos-7细胞;荧光显微镜观察Cos-7细胞红色荧光蛋白表达情况。流式细胞仪方法检测红色荧光蛋白中Mix1的基因表达率,以此计算转染效率。转染后48h提取细胞总RNA,进行RT-PCR检测Mxi1基因表达。结果成功构建了一种pDs-red2-N1/Mxi1(野生型/突变型)真核表达载体。荧光显微镜下观察转染后Cos-7细胞可见红色荧光蛋白的表达;流式细胞仪检测野生型和突变型的转染效率以转染后前3d较高,并可持续至第6d。质粒转染Cos-7细胞后均出现阳性Mxi1基因转录产物。RT-PCR方法可以检测到Mxi1基因在Cos-7细胞中的表达。结论 Mxi1的真核表达载体构建成功,通过脂质体的方法转染真核细胞中并在其胞浆中表达。

MXD1在胰腺癌中的表达分析及其对细胞增殖、迁移和Warburg效应的影响

目的:探讨MAX二聚化蛋白1(MAX dimerization protein 1,MXD1)基因在胰腺癌组织和细胞中的表达情况,及其对胰腺癌细胞增殖、迁移和Warburg效应的影响。方法:分别利用基因表达谱数据动态分析(Gene Expression Profiling Interactive Analysis,GEPIA)和基因表达综合(Gene Expression Omnibus,GEO)数据库分析MXD1基因在胰腺癌及其癌旁组织中的表达差异。应用免疫组织化学染色法检测MXD1在311例胰腺癌组织中的表达水平,并通过Kaplan-Meier法分析MXD1表达水平与患者预后的相关性。采用实时荧光定量PCR法检测人胰腺癌细胞系中MXD1 mRNA的表达水平。采用脂质体法将2条针对MXD1基因不同靶点的siRNA(siMXD1-1和siMXD1-2)分别转入人胰腺癌细胞系BxPC-3和Patu8988,用实时荧光定量PCR法和蛋白质印迹法检测siRNA对MXD1表达的干扰效果。采用CCK-8法和Transwell小室实验分别检测干扰MXD1表达对BxPC-3和Patu8988细胞增殖、迁移能力的影响。同时,根据基因集富集分析(Gene Set Enrichment analysis,GESA)推断MXD1可能影响胰腺癌细胞的Warburg效应。用糖酵解压力测试实验检测干扰MXD1表达对胰腺癌细胞的细胞外酸化率(extracellular acidification rate,ECAR)的影响。结果:MXD1在胰腺癌组织中的表达水平明显高于癌旁组织(P<0.05)。MXD1高表达患者的总生存(overall survival,OS)率较MXD1低表达者低(P<0.01)。MXD1 mRNA在BxPC-3和Patu8988细胞中表达水平相对较高(P<0.05);干扰MXD1表达后,BxPC-3和Patu8988细胞中MXD1mRNA和蛋白的表达水平明显下调(P<0.05),其细胞增殖(P<0.05)和迁移能力(P<0.01)也明显降低。糖酵解压力测试结果显示,干扰MXD1表达后胰腺癌细胞的ECAR水平明显降低(P<0.05)。结论:MXD1在胰腺癌组织中高表达,其高表达与患者不良预后相关;干扰MXD1表达会抑制胰腺癌细胞的增殖、迁移以及Warburg效应。