Maxadilan对诱导多能干细胞增殖的作用

目的:探讨垂体腺苷酸环化酶激活肽(PACAP)的PAC1受体特异激动剂maxadilan对人诱导多能干细胞(IPSCs)增殖的作用。方法:培养人IPSCs,利用RT-PCR和Western blotting检测IPSCs的PAC1受体;IP-SCs培养基中加入不同浓度的maxadilan作为实验组,未加入maxadilan作为对照组。CCK-8法检测maxadilan对IPSCs增殖的影响;流式细胞仪分析maxadilan对细胞周期的影响;染色体核型分析检测maxadilan对IPSCs核型的影响;real-time-qPCR和免疫荧光法从基因及蛋白水平检测maxadilan对IPSCs的多能性基因Nanog和OCT4的影响;real-time qPCR检测maxadilan对IPSCs及其形成胚体细胞的Nestin和PAX6基因的影响;RT-PCR检测maxadilan对IPSCs分化为三胚层能力的影响。结果:RT-PCR和Western blotting均显示IPSCs含有PAC1受体;CCK-8法显示100 nmol/L maxadilan组比对照组细胞增多16%(P<0.05);流式细胞仪分析显示孵育100 nmol/Lmaxadilan 3 h、6 h和9 h后IPSCs增殖指数为47.23%、59.70%、55.67%,与对照组37.00%相比,差异显著(P<0.05);染色体核型分析显示maxadilan处理过的IPSCs核型正常;RT-PCR、real-time qPCR和免疫荧光法显示maxadilan未影响IPSCs多能性。结论:人IPSCs存在PAC1受体,maxadilan对人IPSCs具有促进细胞增殖作用且没有影响IPSCs的多能性和染色体核型。

Maxadilan 对兔角膜上皮细胞的促增殖作用

目的探讨垂体腺苷酸环化酶激活肽(pituitary adenylate cyclase activating polypeptide,PACAP)的PAC1受体特异激动剂Maxadilan对角膜上皮细胞的促增殖作用。方法分离新西兰大白兔角膜上皮细胞,并在含体积分数10%胎牛血清的DMEM培养基中培养。利用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测兔角膜上皮细胞PACAP的PAC1受体;细胞增殖实验采用CCK-8法检测,角膜上皮细胞培养基中分别加入0.01μmol.L-1、0.03μmol.L-1、0.05μmol.L-1、0.10μmol.L-1、0.15μmol.L-1Maxadilan作为实验组,未加入Maxadilan作为对照组,检测不同浓度的Maxadilan对角膜上皮细胞增殖的影响;流式细胞仪分析0.10μmol.L-1Maxadilan对细胞周期的影响。结果 RT-PCR检测显示兔角膜上皮细胞含有PACAP的PAC1受体;CCK-8法检测显示0.05μmol.L-1、0.10μmol.L-1、0.15μmol.L-1Maxadilan实验组分别比对照组细胞增多29.1%、41.5%、32.5%,与对照组相比差异有统计学意义(P分别为0.001、0.000、0.000);流式细胞仪分析显示0.10欁μmol.L-1Maxadilan组细胞增殖指数平均值为35.98%,与对照组细胞细胞增殖指数平均值29.48%相比,差异有统计学意义(P=0.014)。结论角膜上皮细胞存在PACAP的PAC1受体,Maxadilan对角膜上皮细胞有促增殖作用。

Maxadilan对人脂肪干细胞的影响

目的:探讨垂体腺苷酸环化酶激活肽Ⅰ型受体(PAC1受体)特异激动剂maxadilan对人脂肪干细胞(adipose-derived stem cells,ASCs)的增殖、凋亡和分化潜能的作用。方法:取人脂肪组织通过酶消化法分离培养ASCs。流式细胞术鉴定ASCs表面标志物,并进行ASCs向成骨成脂定向诱导。CCK-8法和流式细胞术检测maxadilan对ASCs活性的影响。采用波长为254 nm的紫外线(ultraviolet C,UVC)照射ASCs,CCK-8法测定不同剂量的UVC诱导ASCs凋亡后的吸光度。选择剂量为702 J/m2的UVC照射ASCs 24 h后,用流式细胞术和caspase 3和caspase 9试剂盒检测maxadilan对ASCs凋亡的影响。结果:流式细胞术检测表明细胞CD29、CD44、CD59和CD105表面抗原阳性,证实所提取的细胞是ASCs。CCK-8法检测发现80 nmol/L浓度的maxadilan对ASCs促增殖作用最强,流式细胞术分析也证实80 nmol/L maxadilan处理显著促进ASCs的增殖,与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)。与仅被702 J/m2UVC照射的ASCs比较,80 nmol/L maxadilan显著抑制同等剂量UVC照射ASCs所诱导的、与caspase 3和caspase 9活性相关的细胞凋亡,2组比较差异有统计学意义(P<0.05)。同时,2组细胞成骨和成脂的诱导分化均为阳性。结论:Maxadilan促进ASCs增殖,抑制ASCs凋亡,且不改变细胞向成骨和成脂诱导分化的潜能。Maxadilan有利于ASCs的体外生长与扩增。

重组Maxadilan的制备与鉴定

为利用基因工程技术获得重组Maxadilan(RMMAX),根据Maxadilan的氨基酸序列,设计并人工合成了在原核表达的基因。克隆到表达载体pKYB,重组质粒pKYB-MAX转化表达宿主菌Escherichia coli strain ER2566,构建表达工程菌。用诱导剂IPTG诱导由目的多肽、内含肽和几丁质结合域(Chitin binding domain,CBD)组成的"三元"融合蛋白表达;用几丁质珠亲和层析纯化了裂解液中的融合蛋白,用β-巯基乙醇切割融合蛋白,获得目的蛋白。所得的多肽经激光飞行质谱测定分子量结果与理论值相符,生物活性分析表明,重组Maxadilan有显著的提升血糖的作用。

重组PTD-maxadilan的制备与鉴定

为了构建能够有效进入血脑屏障的新型融合蛋白PTD-maxadilan(PTD-MAX),设计编码融合蛋白PTD-MAX基因,克隆到表达载体pKYB,构建重组表达载体pKYB-PTD-MAX,转化大肠杆菌ER2566中。采用IPTG诱导由PTD-MAX、内含肽和几丁质组成的融合蛋白的表达。利用IMPACT(Intein Mediated Purification with an Affinity Chitin-binding Tag)介导的纯化系统制备目的融合蛋白PTD-MAX。所得的目的蛋白经激光飞行质谱测定分子量,结果与理论值相符。动物实验结果表明融合蛋白PTD-MAX能够有效穿越血脑屏障,重组PTD-MAX具有比天然maxadilan更显著(P<0.05)的抑制小鼠摄食的作用。融合蛋白PTD-MAX的构建和制备为其生物学功能的深入开发奠定了基础。