多枝赖草基因组Mb级DNA制备和酶切方法的优化

Mb级DNA的制备和酶切是构建YAC,PAC,BAC,BIBAC和TAC文库与大尺度物理图谱的基础。以浓度0.4%(m/m)NaCl人工模拟盐池中生长的多枝赖草再生叶为材料提取细胞核,经钢丝细胞筛过滤,多次回收滤渣和离心上清中的细胞核,相差显微镜调浓度达108个/mL后,经LMP包埋,蛋白酶K降解核蛋白,脉冲电泳纯化回收后,在LMP胶块中2 Mb以上DNA的浓度约为250 ng/μL。在胶中经Hind III部分酶切再用脉冲电泳回收不同大小范围的DNA,电洗脱浓缩除盐后浓度约为25 ng/μL。用此方法得到的核DNA不但无细胞器DNA等的污染,而且浓度高,可直接用于各种人工染色体文库的构建。

野生大豆核基因组Mb级DNA的制备与酶切

以野生大豆黄化幼苗为材料提取其细胞核DNA,经LMP包埋并用蛋白酶K裂解其中的核蛋白后,采用脉冲电泳回收2 Mb左右细胞核DNA。用HindⅢ对回收细胞核DNA进行部分酶切并用脉冲电泳回收酶切后的DNA片段,经电洗脱、浓缩和透析后DNA溶液浓度可达10 ng.μL-1。连接转化检测结果表明:该DNA可用于后续野生大豆基因组可转化人工染色体(TAC)文库的构建和基因组分析。

多枝赖草基因组可转化人工染色体(TAC)文库的构建和鉴定

为了克隆和转化多枝赖草(Leymus multicaulis)的耐黄矮病、耐蚜虫、耐干旱、耐盐碱等抗逆性基因,利用脉冲电泳分离纯化2Mb以上核DNA,酶切后回收10～200kb DNA片段按大小分5组与TAC载体连接后电转化导入细菌DH10B,在卡那霉素和蔗糖选择压下均有阳性克隆.用两种TAC载体pYLTAC17和pYLTAC747H/sacB分别构建了文库Ⅰ和Ⅱ,约16.5和23.6万个克隆,估计覆盖3～5倍多枝赖草基因组大小.文库以混合克隆形式保存在12×2块深孔96孔板中,每孔1.2mL菌液中含300～600个克隆,40多万个克隆转存到3块384孔板,留24个孔存叶绿体和线粒体DNA探针菌液,可用于后续文库鉴定.此外,从文库Ⅰ和Ⅱ分别挑取2501和2890个单克隆存于14块384孔板中.17块384孔板都用GeneTACTMG3复制了2份,点高密度杂交膜6张,以多枝赖草谷胱甘肽还原酶基因5′RACE-GR和3'RACE-GR为探针初步筛选到19个阳性克隆.两文库为多枝赖草抗性基因的克隆、物理图谱的构建、功能验证等基因组有关研究奠定了基础。