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水牛MBD3基因克隆分析及其真核表达载体的构建
被引量:
3
1
作者
粟小平
肖宁
+4 位作者
罗西尔
雷薇
崔奎青
石德顺
刘庆友
《中国畜牧兽医》
CAS
北大核心
2016年第8期1951-1959,共9页
本研究旨在克隆水牛MBD3基因,进行生物信息学分析,并构建MBD3基因的真核表达载体,为研究MBD3基因在水牛胚胎发育及诱导多能干细胞(iPSCs)中的作用奠定基础。试验从卵巢组织中提取总RNA,反转录得到cDNA,并以此为模板,应用RT-PCR克隆得到M...
本研究旨在克隆水牛MBD3基因,进行生物信息学分析,并构建MBD3基因的真核表达载体,为研究MBD3基因在水牛胚胎发育及诱导多能干细胞(iPSCs)中的作用奠定基础。试验从卵巢组织中提取总RNA,反转录得到cDNA,并以此为模板,应用RT-PCR克隆得到MBD3基因,测序并应用相关的生物学软件进行分析;将MBD3基因连接至真核表达载体pEGFP-C1,再将携带目的基因的重组质粒转染HEK293T细胞和水牛胎儿成纤维细胞(BFF),利用RT-PCR及Western blotting方法分析目的基因的表达。结果表明,克隆获得了898bp的水牛MBD3基因序列,其中编码区全长774bp,编码257个氨基酸。通过对MBD3基因核苷酸序列的多重比对及进化树分析,MBD3基因在进化中高度保守,特别是MBD结构域,水牛与牛的同源性为100%,与人、猪、猩猩的同源性均为97%。将水牛MBD3基因真核表达载体转染HEK293T细胞和BFF,通过荧光观察、RT-PCR及Western blotting方法鉴定表明,成功构建了水牛MBD3基因的真核表达载体。本研究克隆得到了水牛的MBD3基因,并成功构建了MBD3基因的真核表达载体,为进一步研究MBD3基因在水牛胚胎发育及iPSCs诱导上的作用奠定了基础。
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关键词
水牛
mbd3
基因
DNA甲基化
表观遗传
干细胞
下载PDF
职称材料
下调人脐带间充质干细胞Mbd3基因shRNA慢病毒的构建及鉴定
2
作者
闫姗姗
周艳
+4 位作者
李溪
张磊
孙茂盛
解裕萍
李鸿钧
《生物学杂志》
CAS
CSCD
2015年第3期15-20,共6页
研究构建靶向抑制人Mbd3表达的sh RNA慢病毒颗粒,感染人脐带间充质干细胞并用嘌呤霉素筛选获得Mbd3稳定下调的细胞系,为进一步探讨Mbd3在诱导型多潜能干细胞形成中的作用提供实验基础。研究根据Gene Bank中公布的Mbd3基因序列设计特异性...
研究构建靶向抑制人Mbd3表达的sh RNA慢病毒颗粒,感染人脐带间充质干细胞并用嘌呤霉素筛选获得Mbd3稳定下调的细胞系,为进一步探讨Mbd3在诱导型多潜能干细胞形成中的作用提供实验基础。研究根据Gene Bank中公布的Mbd3基因序列设计特异性si RNA干扰序列并合成可产生sh RNA的双链DNA,经双酶切后克隆至p LVsh RNA-EGFP(2A)Puro载体上构建慢病毒重组质粒,转化DH5α大肠杆菌PCR检测筛选阳性质粒,利用HEK293Ta包装产生含有Mbd3sh RNA的慢病毒颗粒。通过RT-PCR和Western blot检测慢病毒感染人脐带间充质干细胞(h UC-MSC)后Mbd3的转录和蛋白表达情况,进一步检测重组慢病毒对Mbd3的沉默效果并筛选出最佳抑制效果的sh RNA慢病毒载体。结果显示成功构建并筛选出下调Mbd3的最佳慢病毒干扰载体,慢病毒感染人脐带间充质干细胞48h后于荧光显微镜下可见绿色荧光,经嘌呤霉素筛选9 d后,RT-PCR检测Mbd3表达显著降低,Western blot检测Mbd3蛋白表达明显减少。说明构建的sh RNA重组慢病毒包装成功,具有较高的感染活性,可有效抑制人脐带间充质干细胞Mbd3的表达,为后续研究脐带间充质干细胞跨胚层分化打下前期研究基础。
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关键词
mbd3
基因
基因沉默
慢病毒载体
RNA干扰
下载PDF
职称材料
题名
水牛MBD3基因克隆分析及其真核表达载体的构建
被引量:
3
1
作者
粟小平
肖宁
罗西尔
雷薇
崔奎青
石德顺
刘庆友
机构
广西大学
出处
《中国畜牧兽医》
CAS
北大核心
2016年第8期1951-1959,共9页
基金
国家自然基金(31260552)
国家高技术研究发展计划(863计划)(2013AA102504)
文摘
本研究旨在克隆水牛MBD3基因,进行生物信息学分析,并构建MBD3基因的真核表达载体,为研究MBD3基因在水牛胚胎发育及诱导多能干细胞(iPSCs)中的作用奠定基础。试验从卵巢组织中提取总RNA,反转录得到cDNA,并以此为模板,应用RT-PCR克隆得到MBD3基因,测序并应用相关的生物学软件进行分析;将MBD3基因连接至真核表达载体pEGFP-C1,再将携带目的基因的重组质粒转染HEK293T细胞和水牛胎儿成纤维细胞(BFF),利用RT-PCR及Western blotting方法分析目的基因的表达。结果表明,克隆获得了898bp的水牛MBD3基因序列,其中编码区全长774bp,编码257个氨基酸。通过对MBD3基因核苷酸序列的多重比对及进化树分析,MBD3基因在进化中高度保守,特别是MBD结构域,水牛与牛的同源性为100%,与人、猪、猩猩的同源性均为97%。将水牛MBD3基因真核表达载体转染HEK293T细胞和BFF,通过荧光观察、RT-PCR及Western blotting方法鉴定表明,成功构建了水牛MBD3基因的真核表达载体。本研究克隆得到了水牛的MBD3基因,并成功构建了MBD3基因的真核表达载体,为进一步研究MBD3基因在水牛胚胎发育及iPSCs诱导上的作用奠定了基础。
关键词
水牛
mbd3
基因
DNA甲基化
表观遗传
干细胞
Keywords
buffalo
mbd3 gene
DNA methylation
epi
gene
tic
stem cell
分类号
Q785 [生物学—分子生物学]
下载PDF
职称材料
题名
下调人脐带间充质干细胞Mbd3基因shRNA慢病毒的构建及鉴定
2
作者
闫姗姗
周艳
李溪
张磊
孙茂盛
解裕萍
李鸿钧
机构
中国医学科学院北京协和医学院医学生物学研究所云南省重大传染病疫苗研发重点实验室
昆明医科大学附属第一医院骨科
出处
《生物学杂志》
CAS
CSCD
2015年第3期15-20,共6页
基金
云南省重点新产品开发计划(2012AE001)
协和青年基金和中央高校基本科研业务费专项资金(33320140082)
文摘
研究构建靶向抑制人Mbd3表达的sh RNA慢病毒颗粒,感染人脐带间充质干细胞并用嘌呤霉素筛选获得Mbd3稳定下调的细胞系,为进一步探讨Mbd3在诱导型多潜能干细胞形成中的作用提供实验基础。研究根据Gene Bank中公布的Mbd3基因序列设计特异性si RNA干扰序列并合成可产生sh RNA的双链DNA,经双酶切后克隆至p LVsh RNA-EGFP(2A)Puro载体上构建慢病毒重组质粒,转化DH5α大肠杆菌PCR检测筛选阳性质粒,利用HEK293Ta包装产生含有Mbd3sh RNA的慢病毒颗粒。通过RT-PCR和Western blot检测慢病毒感染人脐带间充质干细胞(h UC-MSC)后Mbd3的转录和蛋白表达情况,进一步检测重组慢病毒对Mbd3的沉默效果并筛选出最佳抑制效果的sh RNA慢病毒载体。结果显示成功构建并筛选出下调Mbd3的最佳慢病毒干扰载体,慢病毒感染人脐带间充质干细胞48h后于荧光显微镜下可见绿色荧光,经嘌呤霉素筛选9 d后,RT-PCR检测Mbd3表达显著降低,Western blot检测Mbd3蛋白表达明显减少。说明构建的sh RNA重组慢病毒包装成功,具有较高的感染活性,可有效抑制人脐带间充质干细胞Mbd3的表达,为后续研究脐带间充质干细胞跨胚层分化打下前期研究基础。
关键词
mbd3
基因
基因沉默
慢病毒载体
RNA干扰
Keywords
mbd3 gene
gene
silencing
lentiviral vector
RNA interference
分类号
Q782 [生物学—分子生物学]
R556.5 [医药卫生—血液循环系统疾病]
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职称材料
题名
作者
出处
发文年
被引量
操作
1
水牛MBD3基因克隆分析及其真核表达载体的构建
粟小平
肖宁
罗西尔
雷薇
崔奎青
石德顺
刘庆友
《中国畜牧兽医》
CAS
北大核心
2016
3
下载PDF
职称材料
2
下调人脐带间充质干细胞Mbd3基因shRNA慢病毒的构建及鉴定
闫姗姗
周艳
李溪
张磊
孙茂盛
解裕萍
李鸿钧
《生物学杂志》
CAS
CSCD
2015
0
下载PDF
职称材料
已选择
0
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