红肉苹果MdMKK9互作蛋白的筛选与鉴定

MKK9是丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)家族重要成员之一,是在植物细胞响应外界胁迫信号转导中发挥重要作用的酶。为深入研究苹果MKK9的相关功能,以红肉苹果‘黛红’为材料,克隆到MdMKK9基因CDS序列,利用酵母双杂交试验筛选苹果cDNA文库,并通过酵母双杂交筛选、体内双分子荧光互补(BiFC)和体外Pull-down试验进行MdMKK9互作蛋白验证。结果表明,通过对苹果cDNA文库的筛选,共获得11个参与调控植物生长发育及应答逆境胁迫的候选互作蛋白;选取花青苷合成相关蛋白MdCHS及氮胁迫调控相关蛋白MdSPX3进行酵母双杂交、体内BiFC及体外Pull-down试验,结果证明MdMKK9可与MdSPX3互作。

苹果丝裂原活化蛋白激酶MdMKK9互作蛋白筛选与验证

以红肉苹果‘黛红’和‘新疆4号’果皮和果肉为试材,构建红肉苹果cDNA文库,通过酵母双杂交及体内双分子荧光互补(bimolecular fluorescence complementation,BiFC)等方法进行丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)家族重要成员之一的MAPK激酶9(mitogen-activated protein kinase kinase 9,MKK9)互作蛋白筛选及验证。结果表明:以红肉苹果MdMKK9为诱饵筛选红肉苹果cDNA文库,筛选测序后初步得到10个候选的互作蛋白,分析发现其功能与植物花青苷合成及逆境胁迫相关。进一步通过酵母双杂交试验验证,10个候选蛋白中只有成髓细胞瘤域蛋白质(myeloblastosis domain protein,MYB)基因家族的MYB87与MdMKK9互作。通过体内BiFC试验,进一步验证了MdMKK9与MdMYB87互作。

红肉苹果丝裂原活化蛋白激酶激酶9基因的克隆及其在氮胁迫条件下的表达分析

MKK9是丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)级联信号转导途径中的重要成员。本研究从红肉苹果(Malus sieversii f.neidzwetzkyana)‘黛红’中克隆到MdMKK9基因(GenBank登录号为ON427820),其开放阅读框为945 bp,编码314个氨基酸的蛋白质,分子量35502 Da,等电点7.36。MdMKK9蛋白含有高度保守的特异结构域S/TxxxxxS/T激活基序及“DIK”活性位点,亚细胞定位显示MdMKK9存在于细胞核。‘黛红’组培苗在低氮培养过程中逐渐变红,MdMKK9基因上调表达,花青苷含量增加。构建CRISPR/Cas9 MdMKK9基因编辑载体,并成功转化‘王林’愈伤组织(CR),与转PRI101-MdMKK9过表达载体的‘王林’愈伤组织(OE)相比,随着培养基中氮素浓度降低,OE愈伤组织逐渐变红,花青苷含量升高,而CR愈伤组织颜色和花青苷含量均无变化。研究结果表明,MdMKK9基因通过介导植物对氮的吸收,调节红肉苹果组培苗和转基因愈伤组织在低氮胁迫时对花青素的合成。