大肠杆菌诺氟沙星超敏感多基因敲除株KYAH06构建与功能验证

以E.coli DH5α为出发菌株采用pKD46质粒提供λRed重组系统完成以下三步基因敲除:大肠杆菌中RND超家族多药物抗性蛋白acrAB基因并借助其与pKD3质粒的氯霉素抗性片段同源重组被敲除;大肠杆菌中MATE家族多药物抗性蛋白ydhE基因通过卡那霉素抗性筛选和蔗糖反向筛选被无痕敲除;大肠杆菌中主要负责诺氟沙星外排的MFS超家族转运蛋白mdtH基因通过与pK18mobSacB质粒中的抗性片段的同源重组被敲除。以上基因敲除不同程度导致大肠杆菌对诺氟沙星的敏感性变化,最终获得诺氟沙星敏感性为0.0125μg·mL^(-1)的E.coli KYAH06,为大肠杆菌MdtH详细转运机制以及其他诺氟沙星外排转运蛋白鉴定和功能分析奠定试验基础。