木薯MeMLO12基因克隆及其CRISPR-Cas9表达载体的构建

MLO基因是植物中特有的一类抗病性负调控因子,该基因突变导致植物产生广谱抗病性。本研究从木薯全基因组中克隆获得木薯MLO12基因的DNA和cDNA序列,并将其命名为MeMLO12。该基因全长3743 nt、编码区(ORF)全长1728 nt,具有一个完整的开放阅读框,含有15个外显子和14个内含子,编码586个氨基酸,蛋白的分子质量为67.2 kDa,等电点为8.85。该基因编码的蛋白定位在内质网膜上,无信号肽,在23~45、74~96、161~183、285~307、312~334、371~393、413~435 aa处形成7次跨膜结构域。qRT-PCR定量分析发现,受木薯黄单胞病菌侵染后,MeMLO12基因在木薯抗、感品种中的表达量存在明显的差异,参与木薯与黄单胞菌之间的互作,表现出负调控作用。选择该基因第11个外显子进行Snap Gene Viewer分析,获得了10 455条sgRNA的种子序列,从中选取3条靶序列约23 nt,碱基组成上3'末端含G结尾,将其构建到CRISPR-Cas9载体上,经验证,确认MeMLO12的3条靶序列已经成功构建到基因编辑载体上,将其命名为pSGR-Cas9-AT-MeMLO12载体。