木薯MeCML24与MeSAUR1互作调控MeAGPS1a表达的功能验证

木薯是华南地区重要的经济作物,其块根富含淀粉。解析木薯块根淀粉合成调控机理将有助于木薯高产、高淀粉分子改良。AGPase由大亚基和小亚基构成,催化1-磷酸葡萄糖和ATP形成腺苷二磷酸葡萄糖和焦磷酸,其中腺苷二磷酸葡萄糖为淀粉生物合成的底物。AGPase酶是植物淀粉合成的限速酶,提高AGPase酶活性,有利于作物淀粉的积累及产量的提高。木薯MeAGPS1a基因编码的小亚基是AGPase的催化中心,前期研究表明生长素响应因子MeSAUR1作为转录因子正调控MeAGPS1a基因表达,酵母双杂交筛选木薯cDNA文库显示钙调素类似蛋白(CaM-like,CML)成员MeCML24为MeSAUR1的候选互作蛋白。为了确定MeCML24和MeSAUR1的互作关系,本研究从‘SC8’木薯品种基因组克隆了MeCML24基因,该基因的CDS区长度为492 bp,编码163个氨基酸。MeCML24蛋白的理化性质及二级结构分析显示,该蛋白理论等电点pI值4.38,属于亲水性蛋白,α-螺旋占52.76%,无规则卷曲占30.06%,β-转角结构占11.04%。构建酵母双杂交载体BD-MeCML24,自激活实验表明MeCML24不具有自激活活性。酵母双杂交点对点实验发现,共转AD-MeSAUR1和BD-MeCML24质粒的酵母菌株在SD/TLHA+x-α-gal培养基上变蓝,表明MeCML24与MeSAUR1存在互作关系。采用双分子荧光互补(BiFC)实验,将融合蛋白MeSAUR1-nEYFP和MeCML24-cEYFP在烟草叶片中共表达,在激光共聚焦显微镜下检测出黄色荧光蛋白EYFP的荧光信号,进一步证明了MeCML24与MeSAUR1互作。最后利用双荧光素酶实验证明MeCML24与MeSAUR1互作负调控MeAGPS1a基因表达。本研究揭示了木薯MeSAUR1与MeCML24协同调控MeAGPS1a基因表达的机制,发现钙调素类似蛋白MeCML24参与调控木薯块根淀粉合成关键基因MeAGPS1a表达,为利用分子生物学技术培育木薯优良品种提供了理论基础。

木薯MeSAUR1互作蛋白的筛选及鉴定

木薯MeAGPS1a基因编码的小亚基是淀粉合成关键酶AGPase的催化中心,前期研究发现MeSAUR1转录因子可结合MeAGPS1a基因启动子并调控该基因表达。采用酵母双杂交技术筛选MeSAUR1转录因子的互作蛋白,可进一步解析MeAGPS1a基因表达的分子调控网络。本研究构建了MeSAUR1的酵母双杂交诱饵载体pGBKT7-MeSAUR1,采用酵母双杂交技术从木薯cDNA文库中筛选MeSAUR1的候选互作蛋白,结果共筛选出31个阳性克隆。通过酵母双杂交点对点实验验证了候选互作蛋白MePP2C与MeSAUR1的互作关系,本研究结果有助于揭示Me SAUR1蛋白调控木薯淀粉合成的互作网络。