Med19过表达慢病毒载体的构建及鉴定

目的：构建含Medl9基因的过表达慢病毒载体。方法：用PCR技术获得Medl9基因片段，将其连接入酶切后的线性慢病毒载体．转化感受态细胞进行PCR及测序鉴定。脂质体转染法共转染293T细胞，荧光显微镜及Westernblot检测转染效率。包装成慢病毒，实时定量PCR检测病毒滴度。结果：成功获取Medl9基因。测序证实所获取基因序列完全正确。荧光显微镜以及WesternNot检测均证实pGC-FU-Med19携有正确的Medl9基因，并能在293T细胞中表达。实时定量PCR检测病毒滴度为2×10^9TU／mL。结论：成功构建Medl9基因慢病毒表达载体，为进一步研究其生物学功能奠定了基础。

中介体复合物亚基19基因沉默对人膀胱癌细胞增殖和成瘤影响的实验研究

目的研究中介体复合物亚基19（midiatocomplexsubunit19，Medl9）基因沉默对人膀胱癌T24细胞株增殖和成瘤作用的影响。方法应用shRNA慢病毒载体感染T24人膀胱癌细胞沉默Medl9基因，应用实时荧光定量PCR和蛋白质印迹方法检测未感染组、阴性对照感染组以及shMedl9感染组细胞的Medl9基因表达情况；流式细胞仪分析各组细胞周期的变化；噻唑蓝（MTT）实验、5-溴脱氧尿嘧啶核苷（BrdU）掺入实验、克隆形成实验评估肿瘤细胞增殖和生长能力；将T24细胞接种于裸鼠，进行小鼠成瘤实验，检测肿瘤细胞的致瘤能力。结果Medl9-shRNA慢病毒感染T24细胞后，感染组Medl9mRNA表达相对含量为0．35±0．03，与未感染组0．75±0．07和阴性对照组1．00±0．07比较差异有统计学意义（P〈0．05）；感染组Medl9蛋白表达量与未感染组和阴性对照组比较有明显差异；感染组G0／G1期细胞比例为（77．50±0．29）％，与未感染组（69．81±0．81）％和阴性对照组（67．53±0．67）％比较差异有统计学意义（P〈0．05）；MTT和BrdU实验表明感染组细胞存活数量和DNA合成较未感染组和阴性对照组显著降低（P〈0．05）；克隆形成实验中感染组克隆数量为（91．33±6．11）个，较未感染组（179．00±18．36）和阴性对照组（191．00±19．16）显著减少（P〈0．05）；小鼠成瘤实验中，24d时感染组肿瘤体积为（596．64±485．36）mm3，质量为（0．57±0．44）g，与未感染组（2611．40±396．68）mm3和（1．94±0．60）g，阴性对照组（2463．21±1451．66）mm3和（2．17±1．75）g，组间比较差异有统计学意义（P〈0．05）。结论Medl9基因沉默后人膀胱癌T24细胞的生长、增殖和成瘤能力均受到显著抑制，提示Medl9基因在膀胱癌形成过程中具有重要作用。使用shRNA技术抑制Medl9基因表达有望成为膀胱癌新的治疗手段之一。