美仁牦牛MYL 9基因克隆、生物信息学分析及组织表达研究

【目的】克隆美仁牦牛肌球蛋白轻链9(myosin light chain 9,MYL9)基因CDS区并对其进行生物信息学分析,检测MYL 9基因的组织表达特征,为探究该基因功能提供一定理论依据。【方法】以美仁牦牛肌肉组织cDNA为模板,利用PCR扩增并克隆美仁牦牛CDS区序列,与其他物种进行相似性比对及系统进化树构建;通过在线软件对MYL9蛋白进行生物信息学分析,利用实时荧光定量PCR检测MYL 9基因在美仁牦牛心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、肌肉、脂肪和睾丸组织中表达情况。【结果】美仁牦牛MYL 9基因CDS区长516 bp,共编码171个氨基酸。系统进化树结果显示,美仁牦牛与野牦牛、普通牛亲缘关系最近,与高山倭蛙亲缘关系最远。MYL9蛋白分子式为C 858 H 1324 N 234 O 274 S 12,原子数为2702,理论等电点为4.85,不稳定系数和总平均亲水性分别为37.22和―0.772,属于稳定亲水性蛋白。MYL9蛋白无信号肽和跨膜螺旋结构,属于非分泌性蛋白;主要定位于线粒体、细胞核、细胞质中,具有17个特异性磷酸化位点。MYL9蛋白二级结构主要由α-螺旋、无规则卷曲、β-折叠和延伸链构成,三级结构预测结果与二级结构一致。实时荧光定量PCR结果显示,MYL 9基因在美仁牦牛心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、肌肉、脂肪和睾丸组织中均表达,且肝脏和肌肉组织中表达量显著高于其他组织(P<0.05)。【结论】本研究成功克隆美仁牦牛MYL 9基因CDS区,探究了MYL 9基因的生物学功能及组织表达特征,研究结果为进一步探究牦牛MYL 9基因功能特征提供了参考。

牦牛DJ-1基因克隆、生物信息学及组织表达分析

为了研究牦牛DJ-1基因的结构及功能,为后续深入研究牦牛DJ-1基因的生物学功能提供了重要的理论依据。以美仁牦牛脂肪组织cDNA为模板,利用RT-PCR克隆牦牛DJ-1基因的编码区序列(CDS),并且利用基因序列进行生物信息学分析,预测结构域及蛋白质理化性质等,再利用RT-qPCR技术进行组织表达分析。结果表明,美仁牦牛DJ-1基因的CDS区全长570 bp,共编码189个氨基酸;牦牛DJ-1结构域预测显示,在DJ-1氨基酸序列的29—168位中有1个含有Pfam的PfpI结构域;通过对DJ-1蛋白结构和功能进行预测,结果显示,无跨膜结构且无信号肽区域,分子质量20.03531 ku,原子总数2870,理论等电点6.84,不稳定系数28.37,表示为稳定的蛋白质;脂肪系数101.11,总平均亲水系数-0.004,为亲水蛋白,共有11个磷酸化位点;同时,亚细胞定位预测结果表明,美仁牦牛DJ-1蛋白主要分布于细胞质和线粒体中,系统进化树表明,美仁牦牛与野牦牛和欧洲牛亲缘关系最近,与北极狐和宽吻海牛亲缘关系最远;RT-qPCR结果表明,在成年美仁牦牛的心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肌肉、脂肪和睾丸组织中均有所表达,在心脏组织和肌肉组织中表达水平最高,在肝脏和睾丸组织中表达水平最低。

牦牛FABP3基因克隆及组织表达谱分析

【目的】分析牦牛心肌脂肪酸结合蛋白3(FABP3)基因的结构和功能,并检测其在成年牦牛和胎牛中的表达水平,为探究该基因在牦牛育种中的生物学功能提供理论参考。【方法】以美仁牦牛的心脏组织为试验材料,PCR扩增FABP3基因,对得到的编码区序列(CDS)进行生物信息学分析;利用实时荧光定量PCR(RT-qPCR),检测FABP3基因在成年牦牛和胎牛心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏及肌肉组织的表达水平。【结果】牦牛FABP3基因编码区序列长度为402 bp,编码133个氨基酸;蛋白质的高级结构主要是β-转角和延伸链;牦牛FABP3蛋白不存在跨膜区域和信号肽,属于具有一定亲水性的稳定蛋白;牦牛FABP3基因CDS区核苷酸及其编码氨基酸序列的同源性分析显示,FABP3基因在牛属动物中具有一定的保守性;系统进化树分析表明,牦牛与野牦牛和瘤牛的亲缘关系最近,与鸡的亲缘关系最远。RT-qPCR结果显示,FABP3基因在成年牦牛和胎牛的心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏及肌肉组织中均有表达,但在胎牛肝脏、脾脏、肾脏和肌肉中的表达水平显著或极显著高于成年牦牛,在成年牦牛肺脏中的表达水平极显著高于胎牛。【结论】克隆了牦牛FABP3基因,探究了FABP3基因在牦牛中的组织表达规律,为进一步研究该基因在牦牛脂肪沉积中的作用提供了基础数据。

美仁牦牛ILK基因克隆及生物信息学分析

为探究美仁牦牛ILK基因的结构与功能,利用PCR技术克隆了美仁牦牛背最长肌ILK基因CDS区序列,并利用在线软件预测和分析其编码氨基酸序列的生物信息学特征。结果表明,美仁牦牛ILK基因编码区长度1 359 bp,共编码452个氨基酸,是一种主要在细胞质中发挥生物学功能的亲水性蛋白;美仁牦牛ILK基因编码蛋白分子式C2276H3580N656O647S30,分子量51 447.27 Da,原子总数7 189,理论等电点8.30,不稳定性指数41.47,共有27个磷酸化位点;同时,亚细胞定位结果表明,美仁牦牛ILK基因主要分布在细胞质中;系统进化树表明,美仁牦牛与野牦牛和普通牛亲缘关系最近,与非洲爪蟾亲缘关系最远。

放牧美仁牦牛屠宰性能和肉品质特性研究

为研究美仁牦牛的屠宰性能和肉品质特性,发掘其遗传资源,随机选取13头美仁牦牛(5头公牛,8头母牛)进行屠宰试验和肉品质相关指标的测定。将检测结果与相关文献进行比对分析,结果表明,放牧美仁牦牛成年公牛的屠宰率52.10%,母牛的屠宰率49.91%。公牛的屠宰率高于查吾拉牦牛、雪多牦牛和环湖牦牛公牛。美仁牦牛公牛的眼肌面积高于雪多牦牛、环湖牦牛公牛,低于查吾拉牦牛和肃南牦牛。美仁牦牛肉的剪切力大于金川牦牛和麦洼牦牛。美仁牦牛肉的蛋白质含量21.20%,氨基酸和脂肪酸种类丰富,比例均衡。综合来看,美仁牦牛产肉性能优良,肉品质相对较好。

基于全基因组重测序对7个牦牛类群的群体结构分析

为了探究美仁牦牛遗传资源的进化历史和群体结构,以分布于甘肃省甘南藏族自治州合作市的美仁牦牛及周边分布的7个牦牛群体为研究对象,基于全基因组重测序技术,结合主成分分析、系统进化树、杂合度分析、群体连锁不平衡分析和群体分化指数等研究其群体进化情况。结果表明,7个牦牛群体间均表现为较高的分化程度;美仁牦牛单独聚为一类,甘南牦牛、雪多牦牛和帕米尔牦牛聚为一类,天祝牦牛、木里牦牛及九龙牦牛聚为一类;7个牦牛群体的期望杂合度均在0.354左右,观测杂合度均低于期望杂合度;美仁牦牛连锁不平衡程度较低,甘南牦牛连锁不平衡程度较高;7个牦牛群体的Fst值均高于0.04。综上说明,这7个牦牛群体间没有过多的基因交流;美仁牦牛在长期的进化过程中形成了一套独特的遗传机制,演变为一个单独的类群。

美仁牦牛乳品质特性分析

为深入开发利用美仁牦牛乳产品,2022年5月份采集了10头美仁牦牛的乳样,采用乳成分测定仪、全自动氨基酸分析仪、气相色谱仪和风味分析仪等对其常规营养成分、氨基酸、脂肪酸和挥发性风味物质含量进行检测。结果表明,美仁牦牛乳的主要营养成分含量为脂肪6.43%,蛋白质5.45%,乳糖5.06%,酪蛋白3.97%,非脂乳固体9.57%,总固形物13.97%;氨基酸总量(TAA)为4.78 g/100 g,其中谷氨酸含量最高,为1.03 g/100 g,甘氨酸含量最低,为0.08 g/100 g,必需氨基酸(EAA)为1.81 g/100 g,非必需氨基酸(NEAA)为2.97 g/100 g,EAA/TAA为37.9%,EAA/NEAA为60.9%;脂肪酸主要以不饱和脂肪酸为主,其中主要是单不饱和脂肪酸,占70.58%;多不饱和脂肪酸主要以γ-亚油酸为主,占1.32%;美仁牦牛乳中共检测出34种挥发性风味物质,包括醛类8种,脂类6种,酮类6种,醇类5种,酸类3种以及其他类6种,主要有2,3-丁二酮、乙酸乙酯、异戊醛、2-庚酮、2-丁酮等挥发性物质。

美仁牦牛Akirin1基因克隆及在不同组织中的表达

【目的】Akirin1基因是调控成肌细胞分化的关键基因,克隆美仁牦牛Akirin1基因编码区(CDS)序列进行生物信息学分析,并检测该基因在各组织间的表达特征,为研究调控牦牛肌肉生长的基因功能提供理论依据。【方法】利用RT-PCR技术克隆美仁牦牛Akirin1基因CDS区序列,通过生物信息学软件分析蛋白理化性质和结构,预测蛋白信号肽和磷酸化位点及构建系统进化树;通过qPCR技术检测Akirin1基因在美仁牦牛成年牛各组织间及胎牛肌肉中mRNA的表达水平。【结果】美仁牦牛Akirin1基因CDS区全长579 bp,编192个氨基酸,蛋白相对分子质量为21879.86u,理论等电点8.91,总平均亲水性-0.822,为亲水性蛋白;系统进化树表明:美仁牦牛与普通牛和印度水牛亲缘关系最近,同源性分别为100%、98.44%;Akirin1蛋白有29处磷酸化位点,无信号肽和跨膜区,主要在细胞核中发挥生物学功能;美仁牦牛Akirin1蛋白主要是由α-螺旋和无规则卷曲组成。Akirin1基因在美仁牦牛脂肪组织中表达量最高,与其他组织比较差异显著(P<0.05),且肌肉和心脏组织中的表达量最低;胎牛背最长肌中Akirin1基因表达量显著高于成年牛(P<0.05)。【结论】美仁牦牛Akirin1蛋白为亲水性蛋白,无跨膜结构域,美仁牦牛Akirin1基因与普通牛和印度水牛亲缘关系最近,表明该基因高度保守;Akirin1基因在美仁牦牛不同组织中的表达差异显著,且在胎牛背最长肌中的表达量高于成年牛,推测该基因的表达在牦牛早期的生长发育阶段发挥了重要作用。

牦牛FTL基因克隆、生物信息学及表达分析

旨在了解牦牛铁蛋白轻链(FTL)基因的结构与功能,以及在不同年龄段8个组织中的表达规律。以成年(36月龄)美仁牦牛肝脏组织cDNA为模板,克隆FTL基因的编码区序列,并进行生物信息学分析,利用实时荧光定量(qRT-PCR)技术检测FTL基因在心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、背最长肌、脂肪、睾丸中的相对表达量。结果表明,美仁牦牛FTL基因的CDS区为528 bp,共编码175个氨基酸,与野牦牛和牛的亲缘关系最近(99.8%);FTL蛋白为稳定亲水性分泌蛋白,不存在信号肽和跨膜结构,主要分布在细胞质中,蛋白的二级结构以α-螺旋为主,主要与FTH1、SCARA5、NCOA4等蛋白存在相互作用。qRT-PCR结果显示,FTL基因在成年牛的表达量依次为肝脏、肾脏、睾丸,脾脏、肺脏、脂肪、背最长肌、心脏,在7日龄犊牛的脂肪和背最长肌组织中表达最高,成年牛中肝脏组织表达量最高;通过2个阶段比对发现,脂肪、背最长肌和心脏组织的表达量随美仁牦牛年龄的增长呈下降趋势,而肺脏、脾脏、睾丸、肾脏和肝脏组织的表达量随年龄的增长而升高。

美仁牦牛PHB基因克隆及组织表达

为研究美仁牦牛抗增殖蛋白(PHB)的结构及功能,并探究其在7日龄牛和成年牛的各组织中的表达情况。以美仁牦牛肾脏组织cDNA为模板克隆美仁牦牛PHB基因序列。对基因序列进行生物信息学分析以及对蛋白质进行理化性质预测,实时荧光定量PCR(RT-qPCR)技术检测PHB基因在美仁牦牛2个年龄段8个组织中的相对表达量。结果表明,美仁牦牛PHB基因的CDS区全长819 bp,共编码272个氨基酸;同源性比对发现美仁牦牛与普通牛的同源性最高(99.1%);美仁牦牛PHB蛋白分析显示,PHB蛋白内存在1个N-糖基化潜在位点和2个O-糖基化潜在位点,其氨基酸等电点为5.55,不稳定系数(Ⅱ)为46.07,总平均疏水性为0.045,预测为不稳定疏水性蛋白质;亚细胞定位显示,PHB蛋白位于线粒体(30.4%),蛋白内共有潜在磷酸化位点15个,PHB蛋白高级结构由α-螺旋(56.25%)、无规则卷曲(22.43%)、延伸链(16.54%)和β-转角(4.78%)相互连接而成。RT-qPCR结果显示,美仁牦牛2个发育阶段的8个组织中均有PHB基因的表达。在对比2个时期的PHB基因组织表达规律后发现,7个组织的PHB基因表达量随美仁牦牛的生长发育而降低,在美仁牦牛肝脏、脾脏、肺脏、脂肪和睾丸组织中,PHB基因表达量随年龄显著降低(P<0.05)。

牦牛IGF2基因克隆及生物信息学分析

为探究牦牛IGF2基因生物学的特征及结构,利用RT-PCR方法克隆了IGF2基因CDS区,并进行了生物信息学分析。结果表明,IGF2基因共有5个开放阅读框,编码区长540 bp,共编码179个氨基酸。该基因编码的蛋白分子式为C864H1377N251O257S9,分子量为19681.51 Da,原子总数2758个,理论等电点9.11,不稳定系数为59.56,总平均亲水性为-0.184,属于亲水性蛋白。IGF2编码蛋白具有73个磷酸化位点且仅存在于细胞质中。通过系统进化树的构建,发现美仁牦牛在进化过程中相对保守。

牦牛GOLT1B基因克隆及生物信息学分析

为研究牦牛GOLT1B基因的结构及功能,以美仁牦牛脂肪组织cDNA为模板,克隆牦牛GOLT1B基因的编码区序列(Codingsequence,CDS),并且利用该基因序列进行生物信息学分析、结构域预测及蛋白理化性质预测。结果表明,美仁牦牛GOLT1B基因的CDS区全长417 bp,共编码138个氨基酸;牦牛GOLT1B结构域预测显示,在GOLT1B氨基酸序列的第11~114位有1个Pfam结构域的Got1家族;GOLT1B蛋白预测结果表明,跨膜结构域有3处,分别位于氨基酸序列的第13~30位、第34~56位以及第69~91位,无信号肽区域,其氨基酸分子质量15425.69 Da,原子总数2232个,等电点10.36,不稳定系数25.43,为稳定的蛋白质,脂肪系数117.10,总平均亲水系数1.087,为疏水蛋白,共有10个磷酸化位点;同时,亚细胞定位结果表明,美仁牦牛GOLT1B基因主要分布于细胞外基质和细胞壁中;系统进化树表明:美仁牦牛与野牦牛和欧洲牛的亲缘关系最近。

美仁牦牛 PDK4 基因克隆及组织表达

为研究美仁牦牛PDK4基因在各组织中的表达特征,探索其与脂肪沉积机制的相关性,采集了美仁牦牛背最长肌、心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、脂肪和睾丸等组织样,并提取了其总RNA,通过RT-PCR、生物信息学软件及qPCR等技术对美仁牦牛PDK4基因进行了扩增、生信分析和表达特征研究。结果表明,美仁牦牛PDK4基因CDS区全长1224 bp,编码407个氨基酸,蛋白相对分子质量为46.15914 ku,理论等电点6.60,总平均亲水性-0.169,为亲水性蛋白;系统进化树结果表明,美仁牦牛与野牦牛亲缘关系最近,与鬣狗亲缘关系最远;PDK4蛋白有34处磷酸化位点,无信号肽和跨膜区,主要在线粒体中发挥生物学功能;美仁牦牛PDK4蛋白主要是由α-螺旋和无规则卷曲组成。PDK4基因在7日龄美仁牦牛肝脏和肺脏中的表达量显著高于其他组织(P<0.05),在肌肉、脂肪、脾脏和睾丸中中度表达,在肾和心脏中低表达。随着牦牛年龄增长,PDK4基因在30月龄美仁牦牛脂肪组织中的表达量增加,并显著高于7日龄美仁牦牛脂肪中的表达量(P<0.05)。以上结果表明,PDK4基因可能在美仁牦牛的生长过程中参与脂肪调控,在脂肪沉积过程中发挥重要作用。

牦牛SRSF10基因克隆及生物信息学分析

为研究牦牛SRSF10(Serine/argnine-rich splicing factor 10,SRSF10)基因的结构及功能,以美仁牦牛脂肪组织cDNA为模板,克隆牦牛SRSF10基因的编码区(Coding sequence,CDS)序列,并利用基因序列进行生物信息学分析及蛋白理化性质预测。结果表明,美仁牦牛SRSF10基因的CDS区全长789 bp,共编码262个氨基酸;同源性比对发现,牦牛与野牦牛、黄牛之间的SRSF10基因亲缘关系最近(100%),与北极狐最远(97%);牦牛SRSF10蛋白分析显示,SRSF10蛋白内存在2个糖基化位点,1个RRM结构域(74 aa),无跨膜结构域及信号肽区域,其氨基酸等电点11.26,不稳定系数(Ⅱ)101.36,GRAVY=-1.762,预测为稳定的亲水性分泌蛋白;亚细胞定位与核定位预测分析均显示,SRSF10位于细胞核(61.9%),蛋白内共有潜在磷酸化位点63个;SRSF10蛋白高级结构由无规则卷曲(58.02%)、α-螺旋(21.76%)、延伸链(10.69%)和β-转角(9.54%)相互连接而成,主要与同为丝氨酸和富含精氨酸剪接因子、RNA结合蛋白等相关蛋白相互作用。综上所述,SRSF10基因在牦牛脂肪组织中发挥重要作用,该研究结果可为SRSF10基因在牦牛脂肪沉积调控机制的研究提供理论依据,也可为牦牛的遗传育种提供参考。

牦牛GEM基因克隆及生物信息学分析

旨在获得美仁牦牛GEM基因CDS区序列,并通过生物信息学分析了解其生物学特征和结构。选取7日龄健康美仁牦牛公犊牛,屠宰后收集其心肌组织,并提取心肌组织总RNA,运用RT-PCR技术克隆美仁牦牛GEM基因序列。结果表明,获得美仁牦牛GEM基因序列1478 bp(登录号:XM_005895531.1),其中,CDS区长936 bp,5′UTR 67 bp和3′UTR 475 bp,共有12个开放阅读框,编码311个氨基酸;美仁牦牛GEM蛋白质理论等电点9.72,不稳定指数56.42,半衰期30 h,总平均亲水性-0.565,为不稳定碱性亲水性蛋白;美仁牦牛GEM属于非分泌蛋白且无信号肽,不具有跨膜结构域,拥有29处磷酸化修饰位点;通过亚细胞定位发现,GEM蛋白主要存在于细胞核内。