武定乌骨鸡MC1R基因多态性与黑色素沉积的关联研究

旨在探究武定鸡乌骨品系和非乌骨品系黑素皮质素受体1(MC1R)基因多态性与黑色素沉积的相关性,以期为后期利用分子遗传学技术选育乌度更深的武定鸡提供理论参考。试验通过测定300日龄武定鸡乌骨品系和非乌骨品系的血浆真黑色素、褐黑色素和碱溶性黑色素含量,分析了MC1R基因外显子的多态位点(SNPs)与黑色素的关系,并检测组织中MC1R基因表达差异。结果发现:武定鸡乌骨品系血浆中3种黑色素指标均高于非乌骨品系。在MC1R外显子区域检测到4个突变位点(T133C、T244C、G460A和C833A),除武定鸡非乌骨品系C833A位点偏离Hardy-Weinberg平衡以外,其余位点均未偏离;武定鸡非乌骨品系G460A位点呈低度多态,其余突变位点均呈中度多态,其中T244C位点CC基因型和G460A位点AA基因型的真黑色素和碱溶性黑色素含量均高于其他基因型,属于优势基因型。此外,武定鸡乌骨品系各组织中MC1R基因表达量均显著高于非乌骨品系,且各组织间的表达趋势为皮肤>肾脏>肝脏>心脏>肌胃>脾脏>腿肌>胸肌。本试验结果表明,MC1R基因T244C位点和G460A位点突变可能会对武定鸡的乌质性状产生影响,推测这2个位点是影响武定鸡乌骨品系和武定鸡非乌骨品系乌度差异的原因之一。

日粮硒添加水平对泰和乌骨鸡生产性能及组织黑色素含量的影响

【目的】研究日粮添加硒对泰和乌骨鸡生产性能及组织黑色素含量的影响,探讨硒影响黑色素合成的作用机制。【方法】选用1日龄泰和乌骨鸡450只,随机分成6个处理组,每组设5个重复,每个重复15只鸡。6组试验鸡分别饲喂基础日粮添加0、0.10、0.30、0.50、0.70和0.90 mg.kg-1硒的日粮,饲养至4周龄。在4周末计算平均日增重和料重比,测定血清和组织谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、酪氨酸酶(TYR)活性和黑色素含量。【结果】基础日粮中添加硒可显著改善泰和乌骨鸡生产性能(P<0.05),当日粮硒添加水平为0.30 mg.kg-1时,泰和乌骨鸡生产性能最佳。添加0.10—0.70 mg.kg-1硒,可显著提高血清、肝脏、肾脏、胸肌和皮肤GSH-Px、TYR活性,并显著提高这些组织的黑色素沉积(P<0.05)。平均日增重、料重比、血清和组织GSH-Px、TYR活性、黑色素含量与日粮硒添加水平呈显著的二次曲线变化(P<0.05)。组织黑色素含量与组织GSH-Px、TYR活性以及组织TYR活性与组织GSH-Px活性存在显著的正相关关系(P<0.05)。泰和乌骨鸡取得最大组织黑色素含量时硒的适宜添加水平高于取得最大日增重时的添加水平。【结论】日粮添加硒可改善泰和乌骨鸡生产性能和提高组织黑色素合成,且乌骨鸡维持组织最佳黑色素沉积时硒的适宜需要量高于维持最大生长需要量。日粮硒促进组织黑色素合成的作用与其提高机体抗氧化能力密切相关。

白绒乌鸡MITF基因的cDNA克隆、表达及其对黑色素沉积的影响

【目的】克隆白绒乌鸡小眼畸形相关转录因子(microphthalmia-associaated transcription factor,MITF)基因序列,研究MITF基因在白绒乌鸡各组织中的表达,探索其对白绒乌鸡体内黑色素沉积的影响,为深入研究乌鸡体内黑色素沉积的内在调控机制奠定理论基础。【方法】以150日龄健康的白绒乌鸡为研究对象,采用简并引物和巢式PCR方法从白绒乌鸡皮肤组织中克隆MITF基因c DNA序列,通过DNAStar、Clustal X、Bio Edit和MEGA4.0等软件对获得的序列进行生物信息学分析;利用实时荧光定量PCR法和紫外分光光度法分别研究白绒乌鸡各组织MITF基因的表达特性和黑色素的沉积规律,并应用线性回归方法分析白绒乌鸡各组织MITF基因表达量与黑色素沉积之间的相关性。【结果】经测序和拼接,最终获得了长度为1 431 bp的白绒乌鸡MITF基因的c DNA序列(登录号:KC879241),该序列包含1个完整的CDS区(25—1 431 bp),编码468个氨基酸,预测蛋白分子量为52.42 k D,等电点为6.47;结构域分析发现该基因编码的氨基酸具有1个保守的基础-螺旋-环-螺旋-亮氨酸拉链(b HLH-zip)结构。同源比对结果表明,该基因CDS区氨基酸序列与原鸡的同源性高达100%;与其他鸟类同源性达98%以上,与哺乳动物同源性为90%左右;氨基酸系统进化树显示,白绒乌鸡MITF与原鸡的亲缘关系最近,与猪和人的亲缘关系最远。荧光定量PCR结果表明MITF基因表达量在白绒乌鸡各组织间差异达极显著水平(P<0.01),其中以皮肤表达量最高,大约为肾的2.9倍、肌胃的4.4倍、肝的11.4倍、肌肉的86.2倍;紫外分光光度计检测结果显示各组织黑色素的沉积规律与各组织MITF基因的表达规律大体相似,总体趋势表现为皮肤>肾>肌胃>肝>肌肉。相关分析表明,白绒乌鸡组织中MITF基因的表达量与黑色素含量呈显著的正相关关系(P<0.05)。【结论】MITF基因在动物进化中高度保守,该基因表达具有组织特异性,对白绒乌鸡体内黑色素沉积起正向调控作用,其高表达可能有助于乌鸡体内黑色素的形成。

泰和乌骨鸡黑色素的体外抗氧化作用

采用分光光度法测定磷钼酸配合物、自由基和丙二醛(MDA)的含量,用于研究酶法提取的泰和乌骨鸡黑色素的总抗氧化能力及其清除自由基和抗脂质过氧化的作用,研究过程中用合成黑色素与之进行比较。结果表明:泰和乌骨鸡黑色素清除羟基自由基的能力虽然低于合成黑色素,但其总抗氧化能力与合成黑色素相当,而清除DPPH自由基和超氧阴离子自由基的能力以及抗脂质过氧化作用都优于合成黑色素,说明泰和乌骨鸡黑色素具有明显的体外抗氧化功能。

饲粮铜添加水平对9～12周龄泰和乌骨鸡生产性能及组织黑色素含量的影响

本试验旨在研究饲粮铜添加水平对9～12周龄泰和鸟骨鸡生产性能及组织黑色素含量的影响。选用57日龄泰和乌骨鸡270只，随机分成6组，每组3个重复，每个重复15只鸡。试验鸡饲喂在基础饲粮（铜含量为4．80mg／kg）中分别添加0、5、15、30、60、125mg／kg铜的饲粮，饲养至84日龄。结果表明：饲粮铜添加水平对9～12周龄泰和乌骨鸡平均日增重、平均日采食量和料重比均无显著影响（P〉0．05），但适量添加可显著或极显著影响其血清、肝脏、肾脏、皮肤及肌肉的黑色素含量、酪氨酸酶活性（P〈0．05或P〈0．01），并呈现出随饲粮铜添加水平提高而先升后降的趋势。回归分析袁明，泰和乌骨鸡取得最佳组织黑色素沉积时，玉米-豆粕型饲粮适宜铜添加水平为50～72mg／kg。由此可知，玉米-豆粕型基础饲粮中添加铜对9-12周龄泰和乌骨鸡生产性能无显著影响，但添加适宜水平的铜可提高组织黑色素含量。

饲粮铜添加水平对5～8周龄泰和乌骨鸡生产性能及组织黑色素含量的影响

本试验旨在研究饲粮铜添加水平对5～8周龄泰和乌骨鸡生产性能及组织黑色素含量的影响。选用29日龄泰和乌骨鸡270只,随机分成6组,每组3个重复,每个重复15只鸡。试验鸡饲喂在基础饲粮(铜含量为4.77 mg/kg)中分别添加0、5、15、30、60、125 mg/kg铜的饲粮,饲养至56日龄。结果表明:饲粮添加适量铜可显著影响5～8周龄泰和乌骨鸡平均日增重、平均日采食量和料重比(P<0.05),且在30 mg/kg时生产性能达到最佳。饲粮添加适量铜可显著或极显著影响血清、肝脏、肾脏、皮肤及肌肉的黑色素含量及酪氨酸酶活性(P<0.05或P<0.01),并呈现出随饲粮铜添加水平的提高先升后降的趋势。当饲粮铜添加水平为30 mg/kg时,血清和组织酪氨酸酶活性及组织黑色素含量达到峰值。由此可知,玉米-豆粕型基础饲粮中添加铜可提高生产性能和组织黑色素含量,其适宜添加水平为30 mg/kg。

乌骨鸡黑色素的高效液相色谱法测定

建立了乌骨鸡黑色素氧化产物2,3-二羧酸吡咯(PDCA)和2,3,5-三羧酸吡咯(PTCA)的HPLC测定方法,对乌骨鸡中黑色素进行定量研究。采用Kromasil C18柱(250 mm×4.6 mm,5μm)分离,二极管阵列检测器检测,流动相为甲醇-0.1%甲酸,梯度洗脱,检测波长分别为282.8 nm和269.8 nm,并采用LC-MS对色谱峰进行定性。结果表明:PDCA和PTCA能得到很好的分离,经过初步分离纯化的乌骨鸡黑色素粗品中黑色素的含量为76.3279μg/mg。

泰和乌鸡出雏后黑色素的分布与沉积

对1～28周龄的泰和乌鸡进行外表和解剖观察。就个体而言 ,除腿部皮肤略黑一些外 ,全身皮肤的黑度非常接近 ,胸肌的黑度明显浅于腿肌 ,黑度随周龄增加而变浅 ;气管、肺、嗉囊、腺胃外皮、肌胃外皮、睾丸、卵巢在2周龄时可见黑色素沉积 ,随周龄增加而逐渐加深 ;胸皮、腿皮、胸肌、腿肌和腿骨(带骨膜)中黑色素沉积率及左侧髋关节处皮肤黑度之间的表型相关均呈显著的正强相关 ,它们均能较好地代表乌鸡体内黑色素的沉积速度 ;

乌骨鸡黑色素对延缓果蝇衰老的作用

用盐酸降解蛋白质法提取乌骨鸡黑色素，研究其对超氧阴离子（Ｏ－·２）的清除作用，并进行了延缓果蝇衰老的生物学实验。结果表明：（１）在核黄素和甲硫氨酸光照生成的Ｏ－·２体系中，乌骨鸡黑色素能减少氮蓝四唑（ＮＢＴ）还原产物甲的生成，光化还原抑制率和黑色素浓度有一定的关系，证明乌骨鸡黑色素能清除Ｏ－·２，具有类似ＳＯＤ的功能。（２）乌骨鸡黑色素能延长果蝇的平均寿命，提高果蝇的性活力，降低果蝇的脂褐素含量（Ｐ＜０．０５），表明乌骨鸡黑色素具有延缓衰老的作用。

饲粮铜添加水平对泰和乌骨鸡生产性能和组织黑色素含量的影响

本试验旨在研究饲粮铜添加水平对1～28日龄泰和乌骨鸡生产性能和组织黑色素含量的影响。选用1日龄泰和乌骨鸡270只,随机分成6组,每组设3个重复,每个重复15只鸡。试验鸡分别饲喂在基础饲粮(铜含量为4.75 mg/kg)中添加0、5、15、30、60、125 mg/kg铜的饲粮,饲养至28日龄。结果表明:饲粮铜不同添加水平对1～28日龄泰和乌骨鸡平均日增重、平均日采食量和料重比均无显著影响(P>0.05),但适量添加可显著或极显著影响其血清、肝脏、肾脏、皮肤及肌肉的黑色素含量、酪氨酸酶活性(P<0.05或P<0.01),并呈现出随饲粮铜添加水平的提高先升后降的趋势。当饲粮铜添加水平为30 mg/kg时,泰和乌骨鸡血清和组织酪氨酸酶活性及黑色素含量达到峰值。由此可知,玉米-豆粕型基础饲粮中添加铜可提高泰和乌骨鸡组织黑色素含量,其适宜添加水平为30 mg/kg。

乌骨鸡黑色素的提取分离及抗氧化活性研究

采用双酶水解法提取乌骨鸡黑色素,研究碱液脱除蛋白,分离乌骨鸡黑色素的工艺条件。以腹腔注射D-半乳糖法建立小鼠氧化损伤模型,灌胃给予不同剂量乌骨鸡黑色素(500、250、100mg/kgbw),观察其抗氧化活性。结果表明:碱液脱除蛋白分离乌骨鸡黑色素的最佳工艺条件为NaOH溶液(pH10),温度60℃,时间1.5h,料液比1:10,提取4次。与模型组比较,乌骨鸡黑色素组小鼠血和肝脏中GSH-Px活力显著升高,MDA水平显著降低。乌骨鸡黑色素具有较强的体内抗氧化作用。

乌骨鸡黑色素皮质激素受体-1基因的克隆、序列分析与原核表达

【目的】克隆乌骨鸡黑色素皮质激素受体-1(melanocortin 1-receptor,MC1R)基因,并对其进行生物学分析和原核表达。【方法】采集乌骨鸡的肌肉组织,提取其总RNA,根据GenBank上公布的原鸡(Gallus gullus)MC1R基因序列设计引物,利用反转录RT-PCR克隆乌骨鸡MC1R基因,对其进行生物学分析,并构建原核表达载体pET32a-MC1R,在大肠杆菌BL21(DE3)中进行表达。【结果】乌骨鸡MC1R序列由945个碱基组成,编码314个氨基酸。成功构建了重组质粒pET32a-MC1R的原核表达系统,并且体外诱导获得了MC1R蛋白。【结论】成功克隆了乌骨鸡MC1R基因并分析了其与乌骨鸡乌色性状的关系,其与原鸡的亲缘关系最近,达99.4%,经原核表达获得了乌骨鸡MC1R蛋白。

乌鸡黑色素对果蝇的紫外辐射保护作用

对黄体果蝇进行紫外辐射处理后,在含0.02或0.2mg/mL乌鸡黑色素的培养基中培养,通过测定果蝇寿命、繁殖力和SOD比活性来分析黑色素的紫外辐射保护作用。结果显示:果蝇在5min紫外辐射+0.2mg/mL黑色素组的下四分位(14.5±1.3)d、上四分位寿命(23.5±2.1)d以及平均寿命(15.7±7.1)d显著(P<0.05)高于5 min紫外辐射组(8.0±1.4)、(16.0±3.3)和(13.5±6.4)d。每对亲本果蝇在2min紫外辐射+0.2mg/mL黑色素组繁殖子代(50.0±11.4)只比2min紫外辐射组提高了156.4%(P<0.05)。另外,黑色素可能对辐射处理果蝇体内SOD比活性有保护作用,果蝇在5min紫外辐射+0.02mg/mL黑色素组和5min紫外辐射+0.2mg/mL黑色素组的SOD比活性((209.1±13.1)和(213.25±7.7)μmol/(mg.min))高于5min紫外辐射组((204.2±11.5)μmol/(mg.min)),但差异均不显著。本试验发现乌鸡黑色素能够延长辐射处理果蝇的寿命,提高繁殖力,对其SOD活性可能也具有保护作用。上述作用或许与黑色素清除自由基的特性有关,同时,2min紫外辐射+0.2mg/mL黑色素组高繁殖力的原因可能还与黑色素对果蝇生殖细胞的保护有关。

乌骨鸡黑素的一些基本结构特征的初步研究

应用元素分析、电子能谱(XPS)和红外光谱(IR)分析技术对乌骨鸡体内黑素结构特征进行了研究。元素分析结果得到黑素分子中C、H、N、O克原子比率的均值为10:12:1:3.该比值与动物性吲哚黑素的相应元素比例接近。XPS波谱显示出黑素中含有两种价态的硫(S~Ⅵ、S~Ⅰ),其中以低价态占优势,S2p电子结合能比人发黑素要大些。氮原子只有一种价态。IR光谱中有五组明显吸收峰,其中以主要表征吲哚环的1619—1632CM^(-1)处的吸引峰最强。以上结果初步表明出乌骨鸡黑素是以吲哚环为主体的异聚物。

日粮酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸水平和比例对泰和乌骨鸡生产性能及组织黑色素含量的影响(英文)

本试验旨在研究日粮酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸供给水平和比例对泰和乌骨鸡生产性能和组织黑色素含量的影响。选用612只1日龄泰和乌骨鸡，随机分成17个处理，每个处理设3个重复，每个重复12只鸡（公母各占1／2），饲养至4周龄。采用三因素二次回归正交组合设计试验方法，建立日粮三种氨基酸水平与泰和乌骨鸡日增重和组织黑色素含量的二次回归数学模型，得出0～4周龄泰和乌骨鸡分别取得最大日增重和组织黑色素含量时日粮三种氨基酸适宜供给量和比例模式。结果表明，日粮酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸供给水平和比例显著影响泰和乌骨鸡日增重和胸肌、腿肌黑色素含量（P〈0．01），且泰和乌骨鸡取得最大日增重和组织黑色素含量时日粮三种氨基酸最适水平和比例模式各不相同。当日粮氨基酸含量分别为酪氨酸0．79％、苯丙氨酸1．06％和色氨酸0．13％，三者比例模式为Tyr：Phe：Trp=85：113：14（相对于日粮Lys含量的比值，Lys定为100）时，可取得最大日增重5．81g／d；而当日粮三种氨基酸含量分别为酪氨酸0．81％、苯丙氨酸1．14％和色氨酸0．13％时，胸肌黑色素含量可取得最大值3．73％，三者最佳比例模式为Tyr：Phe：Trp：87：121：14。因此，通过调节日粮酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸供给水平和比例可改善泰和乌骨鸡生产性能以及体内黑色素的沉积。

乌骨鸡黑色素氧化降解产物成分初探

采用蛋白酶/盐酸法分离获得乌骨鸡黑色素,并对其进行透射电镜观察,以NaOH-H2O2氧化法对其进行降解,用乙醚萃取降解产物,对萃取物进行傅里叶红外光谱、GC/MS分析。结果显示,蛋白酶/盐酸法提取的乌骨鸡黑色素呈游离的椭球形、无明显附着物;傅里叶红外光谱在2960～2850cm-1、1470～1370cm-1范围内有强吸收峰,提示降解产物中可能存有烷基基团;通过GC/MS分析发现,乌骨鸡黑色素乙醚萃取物中不含烷烃,乌骨鸡黑色素降解产物中存在C16～C32一系列不同碳链长度烷烃,且烷烃含量随着降解时间的延长而增加,这表明烷烃是在降解过程中逐渐产生的,推测乌骨鸡黑色素结构中可能存有不同链长的脂肪族结构。

日粮酪氨酸水平对0～4周龄泰和乌骨鸡生产性能及组织黑色素含量的影响

为了研究日粮酪氨酸水平对泰和乌骨鸡生产性能和组织黑色素含量的影响，选用1日龄泰和乌骨鸡随机分成3组，每组设3个重复，每重复12只鸡（公母各半），饲养至4周龄。试验鸡组分别饲喂3种酪氨酸水平的日粮，日粮酪氨酸水平分别为0．46％、0．63％和0．80％。结果表明：日粮酪氨酸水平对0-4周龄泰和乌骨鸡平均日增体质量、日采食量和料重比均无显著影响（P〉0．05）。胸肌黑色素含量随日粮酪氨酸水平的提高而显著提高（P〈0．05），而日粮酪氨酸水平对腿肌黑色素含量无显著影响（P〉0．05），但腿肌黑色素含量有随酪氨酸水平提高而增大的趋势。

乌骨鸡黑色素及其降解产物的红外光谱结构解析

采用氨水-过氧化氢法和碳酸钾-过氧化氢法对乌骨鸡黑色素进行降解,并通过傅里叶红外光谱法对乌骨鸡黑色素及其降解产物可溶性部位的红外光谱学性质进行研究。结果显示:乌骨鸡黑色素降解产物可溶性部位与乌骨鸡黑色素在红外图谱上有较多相似之处,在3600～3100cm-1、2950～2850cm-1、1680～1630cm-1、1570～1515cm-1、1240～1200cm-1均有不同强度的吸收峰,特别是在1650cm-1附近均出现乌骨鸡黑色素的特征强吸收峰,推测经过氧化氢降解反应获得的乌骨鸡黑色素降解产物可溶性部位中含有乌骨鸡黑色素骨架结构片段,酰胺基团和环状烯烃可能是构成乌骨鸡黑色素骨架结构的主要基团。

略阳乌鸡黑素皮质素受体1(MC1R)基因变异及蛋白质结构的预测

为弄清略阳乌鸡黑素皮质素受体1(MC1R)基因的遗传变异与黑色素形成的关系,采用PCR-SSCP测序方法,对略阳乌鸡蛋白质理化性质和分子结构进行了研究。结果表明:略阳鸡种内MC1R变异较小,与白来航比对,在编码区69、212、274、376、636、637和644位点有7个SNPs,除69和636位点外,其余5个突变导致略阳乌鸡的MC1R编码区氨基酸序列发生改变,并造成黑素皮质素受体1多了一个磷酸化位点,这些位点的变异可能与略阳乌鸡黑色素的形成和沉积有关;经聚类分析,略阳鸡与原鸡亲缘关系较近,与来航鸡关系较远。略阳乌鸡保留了原始的基因库,MC1R基因可能是控制略阳乌鸡黑色素形成的主效基因。

日粮苯丙氨酸水平对5～12周龄泰和乌骨鸡生产性能及组织黑色素含量的影响

【目的】研究日粮苯丙氨酸水平对5～12周龄泰和乌骨鸡生产性能和组织黑色素含量的影响。【方法】选用28日龄泰和乌骨鸡81只,随机分成3组,每组设3个重复,每重复9只鸡(公母各半),饲养至12周龄。在5～8周龄3个处理组中日粮苯丙氨酸水平分别为6.79,9.14和11.49g/kg,在9～12周龄3个处理组中日粮苯丙氨酸水平分别为6.37,8.28和10.19g/kg。【结果】日粮苯丙氨酸水平对5～8周龄和9～12周龄泰和乌骨鸡的平均日增质量、平均料重比、平均日采食量均无显著影响(P>0.05)。日粮苯丙氨酸水平显著影响8周龄泰和乌骨鸡胸肌的黑色素含量(P<0.05),但对腿肌和皮肤的黑色素含量均无显著影响(P>0.05),日粮苯丙氨酸水平为9.14g/kg时,胸肌黑色素含量最高。日粮苯丙氨酸水平显著影响12周龄腿肌和皮肤的黑色素含量(P<0.05),但对胸肌的黑色素含量无显著影响(P>0.05);腿肌黑色素含量以6.37g/kg苯丙氨酸水平组最高,而皮肤黑色素含量以8.28g/kg苯丙氨酸水平组最高。【结论】通过调节日粮苯丙氨酸供给水平,可改善泰和乌骨鸡体内黑色素的沉积而不影响其生产性能。