应用酵母双杂交技术筛选转录因子MEOX2的相互作用蛋白

目的研究同源盒基因Meox2所编码的转录因子MEOX2在心肌细胞内与哪些蛋白质存在相互作用。方法应用酵母双杂交技术对人心脏cDNA文库进行筛选。(1)通过PCR方法扩增编码组氨酸/谷氨酸(H/Q)富含区缺失的MEOX2蛋白质(Meox2ΔHQ)的DNA片断,并克隆进入pGBKT7载体,从而构建“诱饵”质粒pGBKT7Meox2ΔHQ;(2)将“诱饵”质粒pGBKT7Meox2ΔHQ转化酵母菌AH109,然后从被转化的酵母菌中提取蛋白质,应用抗C Myc单克隆抗体进行免疫印迹分析,检测“诱饵”蛋白的表达;(3)将被“诱饵"质粒转化的AH109分别涂布于SD/Trp、SD/Trp/His、SD/Trp/Ade和SD/Trp/XαGAL平板上,以观察“诱饵”蛋白自我激活报告基因与否;(4)将已被“诱饵”质粒转化的AH109与人心脏cDNA文库进行杂交,筛选阳性克隆,分离阳性克隆中的cDNA,并测序。结果Meox2ΔHQ与pGBKT7中的Gal4DNA结合域及C myc在同一读框,并稳定表达融合蛋白“Gal4DNA结合域C myc Meox2ΔHQ”,“诱饵”蛋白不会自我激活报告基因,筛选得到11个准阳性克隆。结论同源盒基因Meox2所编码的转录因子MEOX2可能与心肌细胞中的多种蛋白质存在相互作用,并参与这些蛋白质表达的调控。

MEOX2基因与先天性小耳畸形相关性研究

目的先天性小耳畸形是我国第二高发的颅面部出生缺陷,以往针对先天性小耳畸形的研究多集中在手术治疗技术和流行病学调查方面,而对导致疾病发生的遗传因素研究极少。MEOX2基因是近些年来发现的同源盒基因,其编码的蛋白是核转录因子,能够激活或抑制其下游基因的表达。方法本研究采用候选基因关联研究的手段揭示其与先天性小耳畸形之间的关系。我们首先基于千人基因组计划数据挑选MEOX2基因的标签SNP,利用飞行时间质谱在328例小耳畸形患者和500例对照中进行了分型。结果发现了2个和小耳畸形显著关联(Bonferroni P<0.05)的位点,分别为rs76405124(P=0.006556,OR=0.82)和rs10224052(P=0.01619,OR=0.83)。采用Impute2进行基因组填充后分析又发现rs71549953亦与小耳畸形显著(Bonferroni P<0.05)相关。结论本研究不仅揭示了小耳畸形新的关联基因,还为该病的遗传病因学研究提供新视角。

同源异型盒基因MEOX2在恶性肿瘤中的研究进展

MEOX2基因属于同源异型盒转录因子家族,与大量信号转导通路有关,是细胞分化、血管生成及胚胎发育等的重要调控基因。MEOX2基因的表达异常与喉癌、肾母细胞瘤等恶性肿瘤的发生发展及淋巴结转移有关,但在乳腺癌、非小细胞肺癌等恶性肿瘤中,不同的研究得出的结论不同,有的认为其在肿瘤的发生发展中起抑制作用,有的则发现其促进肿瘤的发生发展。因此,为了明确MEOX2基因在恶性肿瘤中的具体作用,需要采用新的研究方法,或加大样本量,进行多角度、多中心的研究。

Meox2调控PI3K/AKT信号通路对乳腺癌细胞的增殖及机制的影响

目的:探究间充质同源盒蛋白(Meox2)对乳腺癌细胞增殖能力及其机制的影响。方法:体外培养人乳腺癌细胞株MCF-7,腺病毒转染调高细胞Meox2基因的表达,常规无额外基因序列添加的人乳腺癌细胞株MCF-7细胞设为Control组,含有Meox2基因的腺病毒(Ad-Meox2)转染细胞后设为Ad-Meox2组,以空载体Ad-GFP转染细胞后设为Ad-GFP组。荧光显微镜观察其转染率。采用MTT法和流式细胞仪分别验证过表达的Meox2对乳腺癌细胞在24、48、72 h后细胞的增殖及周期的变化。采用Western blot检测细胞中Meox2及其下游PI3K/AKT通路蛋白的表达。结果:腺病毒转染的MCF-7细胞中Meox2基因表达上调,转染率为95%以上。MTT显示,Ad-Meox2组可明显呈时间依赖性地抑制细胞增殖(P<0.05)。流式细胞仪检测显示Ad-Meox2组可显著阻滞细胞周期的进行,使更多的细胞停滞于S期与G2/M期(P<0.05),同时,阻滞细胞进入下一个周期,即G0/G1期(P<0.05)。Western blot显示各组的MCF-7细胞中PI3K和AKT含量无明显变化(P>0.05),但Ad-Meox2组的p-PI3K和p-AKT蛋白含量较Control组明显下降(P<0.05)。结论:Meox2基因可通过PI3K/AKT信号通路抑制乳腺癌细胞周期的进程,进而抑制乳腺癌细胞的增殖能力,提示Meox2可能是乳腺癌新的治疗靶点。

MEOX2基因与阿尔兹海默病神经血管功能失调的相关性研究

阿尔兹海默病(Alzheimer’s disease,AD)是一种以进行性认知功能障碍和行为损害为特征的脑退行性疾病。目前临床上极度缺乏预防及治疗AD的有效药物。同源盒MEOX2基因又称为GAX基因,主要在心血管系统中高表达,对血管的分化和血管的生成起多方面作用,本课题旨在研究MEOX2基因与AD疾病中神经血管功能失调的相关性,为AD疾病的治疗寻找新的思路。本实验通过双侧侧脑室注射Aβ_(1-42)建立AD大鼠模型,应用Morris水迷宫、免疫组织化学染色、生化检测、免疫印迹(Western blot)及实时定量PCR等方法检测指标进行研究。实验动物饲养及处理均符合中国实验动物伦理学要求。实验结果表明,与对照组相比,AD模型组大鼠有明显的认知功能障碍,伴随着脑内和血清中Aβ的增加、脑内星形胶质指标纤维酸性蛋白(GFAP)、小胶质细胞指标同种异体炎性因子1 (AIF1)、内皮一氧化氮合酶(eNOS)表达的增加和特异性神经元烯醇酶(NSE)、突触素(SYN)、血管功能变化指标CD34、血管内皮生长因子(VEGF)表达的减少,内皮素(ET)浓度增加,一氧化氮(NO)浓度降低。此外,在AD模型大鼠脑内MEOX2和低密度脂蛋白受体相关蛋白1 (LRP-1)减少,晚期糖基化末端产物受体(RAGE)表达增加,表明Aβ诱导的大鼠AD模型中神经血管功能失调可能与MEOX2的降低有关。同时, MEOX2基因的作用与Aβ转运受体LRP-1和RAGE水平的变化存在一定的相关性。

肉鸡肺动脉组织中MEOX2基因克隆与生物信息学分析

克隆构建肉鸡间充质同源盒蛋白2(mesenchyme homeobox,MEOX2)重组质粒pUCm-T-MEOX2,并对其进行生物信息学分析。通过提取肉鸡肺动脉组织基因组RNA,并反转录为cDNA,利用PCR方法扩增MEOX2基因片段,并将目的片段通过TA克隆到pUCm-T载体上获得重组质粒,测序后对其进行生物信息学分析。结果显示,成功获得pUCm-T-MEOX2重组质粒,目的基因片段为819 bp,可编码273个氨基酸,其序列同源性与原鸡无差异;其存在45个磷酸化位点和1个N-糖基化修饰位点;经预测MEOX2蛋白亚细胞定位于细胞核,无信号肽;MEOX2蛋白为亲水性蛋白且无跨膜结构;二级结构预测为α-螺旋、延伸链、β-转角和无规卷曲,分别占22.79%,9.93%,3.68%,63.60%;三级结构主要由无规卷曲和α-螺旋组成;其有11个B细胞抗原表位。本试验结果可为MEOX2基因抗体制备奠定良好的基础,进而为肉鸡腹水综合征的肺动脉血管重构病理检测及基因药物治疗提供有力的依据。

同源盒基因MEOX2在乳腺癌中的表达及其临床意义

[目的]研究乳腺癌组织中MEOX2的表达水平与临床病理资料的相关性,及其对患者预后的影响。[方法]纳入2010—2012年嘉兴市第一医院乳腺病科就诊的乳腺癌患者162例,免疫组化检测组织中MEOX2的表达水平,将患者分为低表达组及高表达组。利用Cox回归模型进行多因素分析,并应用Kaplan-Meier曲线评估患者无复发生存(recurrence free survival,RFS)和总生存(overall survival,OS),Log-rank检验比较生存曲线差异。[结果]MEOX2主要定位于细胞核中,在乳腺癌中表达的阳性率为83.33%(135/162),其中MEOX2低表达的患者有50.62%(82/162),高表达的患者有49.38%(80/162)。MEOX2低表达组患者脉管癌栓的发生率更高(P=0.029)。预后分析结果显示MEOX2高表达与不良预后有关,MEOX2高表达的患者RFS更差(P=0.028),但OS未见统计学差异(P=0.323)。多因素分析显示淋巴结受累、Ki67水平及MEOX2表达水平均为乳腺癌患者发生复发转移事件的独立预测因素。淋巴结受累是发生死亡事件的独立预测因素(P=0.001)。在雌激素受体阴性人类表皮生长因子受体2阳性的乳腺癌患者中,MEOX2高表达与较差的RFS有关(P=0.096),但未达统计学意义;而在其他分型的患者中,MEOX2与预后无明显相关性。[结论]乳腺癌组织中MEOX2表达水平与脉管癌栓相关,其高表达与患者的复发转移事件及不良预后相关,这一相关性在ER阴性Her-2阳性的患者中较为明显。MEOX2可作为乳腺癌患者复发转移事件的预测标志物。

MicroRNA-124抑制大鼠血管平滑肌细胞增殖及分子机制研究

目的探讨MicroRNA-124(miR-124)对大鼠血管平滑肌细胞增殖的作用及可能的调控机制。方法选择10只11周龄雄性SPF级自发性高血压大鼠(SHR)作为实验组及同龄的10只SPF级Wistar大鼠(WKY)为对照组。采用组织贴片法原代培养SHR和WKY主动脉平滑肌细胞。通过实时荧光定量PCR(qRT-PCR)技术检测miR-124在两组主动脉平滑肌细胞间的表达差异。将miR-124模拟物或模拟物阴性对照转染SHR主动脉平滑肌细胞,分析过表达miR-124对血管平滑肌细胞增殖的影响。通过数据库及生物信息学软件预测miR-124的靶基因,并利用双荧光素酶报告基因系统进行验证。通过qRT-PCR和Western blot检测靶基因Meox2 mRNA及蛋白表达变化。采用RNA干扰技术,观察敲低Meox2表达对血管平滑肌细胞增殖的影响。结果 MiR-124在SHR主动脉平滑肌细胞中的表达为WKY主动脉平滑肌细胞的0.22倍(P<0.01)。体外过表达miR-124可明显抑制SHR主动脉平滑肌细胞的增殖。经生物信息学分析及体外双荧光素酶报告基因系统检测,证实Meox2是miR-124的靶基因。过表达miR-124后SHR主动脉平滑肌细胞中Meox2 mRNA的表达为阴性对照组的0.29倍(P<0.01);Western blot结果显示,Meox2蛋白表达水平亦明显降低。干扰Meox2的表达亦可降低SHR主动脉平滑肌细胞的增殖。结论 MiR-124在SHR中表达下调,其可能通过介导Meox2调控主动脉平滑肌细胞的增殖进而抑制高血压病变的发生过程。

miR-301a对三阴性乳腺癌细胞侵袭与增殖的调控作用

目的探讨microRNA-301a(miR-301a)对三阴性乳腺癌(TNBC)细胞的侵袭、增殖的调控作用及潜在的作用机制。方法应用real-time PCR检测miR-301a在MDA-MB-231细胞与MCF-10A细胞中的表达;转染MDA-MB-231,按转染质粒分为Mimics miR-301a组、Mimics NC组、Inhibitor miR-301a组、Inhibitor NC组,通过Transwell小室实验、MTT实验检测miR-301a对MDA-MB-231细胞侵袭及增殖能力的影响;应用生物信息学软件预测miR-301a的下游靶点,并应用荧光素酶报告实验以及Western blot分析miR-301a对靶点的调节作用。结果miR-301a在MDA-MB-231细胞中的表达明显高于正常乳腺细胞(P<0.05);Transwell小室实验提示过表达miR-301a能够增强MDA-MB-231细胞的侵袭能力(P<0..05);MTT实验提示过表达miR-301a能够增强MDA-MB-231细胞的增殖能力(P<0.05);荧光素酶报告实验以及western blot实验证实miR-301a与MEOX2的靶向关系,Mimics miR-301a组MEOX2蛋白表达量明显低于Mimics NC组和空白组(P<0.05),Inhibitor miR-301a组MEOX2蛋白表达量明显高于Inhibitor NC组和空白组(P<0.05)。结论miR-301a在TNBC中高表达,并可通过靶向作用于MEOX2促进TNBC细胞的侵袭、增殖,从而作为TNBC的促癌基因发挥作用。

LINC01006对肾母细胞瘤细胞增殖、侵袭和凋亡的作用及其机制

目的探讨长链非编码RNA LINC01006对肾母细胞瘤细胞增殖、侵袭和凋亡的影响及分子机制。方法通过实时定量PCR检测肾母细胞瘤组织、细胞系中LINC01006的表达。在人肾母细胞瘤细胞中转染LINC01006的腺病毒过表达载体和siRNA,分别采用CCK-8、5-溴脱氧尿嘧啶核苷(5-bromo-2-deoxyuridine,BrdU)细胞增殖检测试剂盒、Transwell侵袭实验、流式细胞术检测细胞活力、增殖、侵袭及凋亡能力的变化。通过生物信息学分析预测LINC01006的靶基因,双荧光素酶报告基因分析验证预测结果;检测过表达和敲低LINC01006后miR-148a-3p及其靶基因中胚层同源盒基因(mesoderm homoobox2,MEOX2)表达水平的变化。随后,分别在裸鼠皮下注射转染腺病毒空载体和LINC01006过表达载体的肾母细胞瘤细胞系,建立小鼠移植瘤模型,测定移植瘤的体积及质量,以及肿瘤组织中LINC01006、miR-148a-3p、MEOX2和磷酸化的磷脂酰肌醇-3激酶(phosphorylated-phosphatidylinositol-3 kinase,p-PI3K)、磷酸化的丝氨酸/苏氨酸激酶,即蛋白激酶B(phosphorylated-protein kinase B,p-PKB/p-Akt)的表达。结果肾母细胞瘤组织和细胞系中LINC01006的表达水平显著低于对照组织和细胞(P<0.01)。LINC01006可抑制肾母细胞瘤细胞的活力(P<0.01)、体外增殖能力(P<0.01)和侵袭能力[(166.00±13.75)vs(103.00±9.24),P<0.05],促进细胞凋亡[(11.30±0.24)vs(37.25±1.57),P<0.01]。双荧光素酶报告基因实验证实LINC01006与miR-148a-3p直接结合,而MEOX2是miR-148a-3p的靶基因。过表达LINC01006抑制了miR-148a-3p的表达[(1.07±0.02)vs(0.32±0.03),P<0.01],而抑制miR-148a-3p的表达促进了MEOX2 mRNA和蛋白水平的表达(P<0.01),进而抑制了PI3K/Akt信号通路的活性(P<0.05)。与转染pcDNA-LINC01006组相比,共转染LINC01006和miR-148a-3p mimic组中MEOX2的表达下调(P<0.01),促进了PI3K/Akt信号通路的活性(P<0.01),细胞活力、增殖和侵袭能力均显著提高(P<0.01),细胞凋亡能力降低(P<0.01)。此外,过表达LINC01006抑制了裸鼠移植瘤的生长(P<0.01)。结论LINC01006可直接与miR-148a-3相互作用并下调其表达水平,从而阻断MEOX2/PI3K/Akt通路的活性,抑制肾母细胞瘤细胞的增殖和侵袭,促进细胞凋亡,抑制肿瘤的生长。